Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Протеогликаны

1.2 Отличие протеогликанов от гликопротеинов

1.3 Классификация протеогликанов

1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов

1.5 Присоединение цепей ГАГ к коровому белку

1.6 Гиалуроновая кислота

1.7 Хондроитинсульфат протеогликаны

1.8 Дерматансульфат протеогликаны

1.9 Гепарансульфат протеогликаны и гепарин

1.10 Кератансульфат протеогликаны

1.11 Биосинтез протеогликанов

1.12 Обмен протеогликанов

1.13 Локализация и функции протеогликанов

1.14 Состав протеогликанов в трансформированных клетках

1.14.1 Декорин

1.14.2 D-глюкуронил С5-эпимераза

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Операционный материал

2.1.2 Антитела

2.2 Методы

2.2.1 Выделение протеогликанов

2.2.2 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот

2.2.3 Идентификация протеогликанов

2.2.4 Аналитические методы

2.2.5 Вестерн-блот

2.2.6 Электрофорез

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Выделение протеогликанов

3.2 Отработка условий проведения электрофореза протеогликанов в агарозном геле

3.3 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот

3.3.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью

3.3.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами

3.4 Сравнение состава протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

3.5 Количественная оценка протеогликанов

3.6 Идентификация фракций протеогликанов

3.6.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами

3.6.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой

3.7 Определение экспрессии декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

3.8 Определение экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

Заключение

Список литературы


Список сокращений

АТ - антитела

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГАГ - гликозаминогликаны

ГС - гепарансульфат

Ге - гепарин

ГК - гиалуроновая кислота

ДС - дерматансульфат

КС - кератансульфат

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - протеогликаны

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХС - хондроитинсульфат

Эпимераза - D-глюкуронил С5-эпимераза

Ac - ацетил

Gal - галактоза

GalN - галактозамин

GlcN - глюкозамин

GlcUA - глюкуроновая кислота

IdoUA - идуроновая кислота

Fuc - фукоза

Man - манноза

SA - сиаловая кислота

Xyl - ксилоза


Введение

Проблема регуляции клеточной пролиферации является одной из ключевых проблем биологии. Нарушения в регуляции деления клеток приводят к изменению их митотической активности, что влечет за собой возникновение различных патологических состояний, в том числе злокачественную трансформацию.

В регуляции клеточного деления принимают участие различные биологические молекулы, в том числе и сложные белково-углеводные молекулы - протеогликаны.

Известно, что определенные представители протеогликанов обладают антимитотической активностью. В нашей группе было показано, что состав и количество протеогликанов в трансформированных клетках меняется. В опухолевых тканях, наряду с общим увеличением количества протеогликанов, снижается содержание дерматансульфат протеогликанов, характерных для покоящихся клеток, и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов, характерных для эмбриональных и активно пролиферирующих тканей. Были получены данные, что протеогликаны являются тканеспецифичными, но не видоспецифичными ингибиторами деления клеток и привлекают внимание как регуляторы клеточной пролиферации, в том числе как перспективные ингибиторы роста злокачественных опухолей.

Для некоторых протеогликанов, в частности, для декорина (дерматансульфат протеогликана), показан механизм антипролиферативного действия (через усиление экспрессии р21-белка и подавление активности циклин-зависимых киназ). Было показано, что в опухолевых клетках содержание декорина уменьшается. Добавление экзогенного декорина или генноинженерных конструкций, содержащих ген декорина, в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу. Однако вопрос о причинах уменьшения содержания декорина в опухолевых клетках до сих пор не поднимался.

Нашей группой было выдвинуто предположение, что возможно, в опухолевых клетках происходят изменения в процессе биосинтеза протеогликанов.

Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, осуществляющий модификацию углеводной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Нарушение экспрессии или изменение активности фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы может служить причиной изменения соотношения хондроитинсульфатов и дерматансульфатов в тканях - уменьшению количества зрелого дерматансульфата (в том числе и декорина).

Для проверки этой гипотезы требуется провести параллельное определение состава протеогликанов и уровня экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы в одних и тех же образцах нормальной и опухолевой ткани. В качестве объекта исследования нами выбрана нормальная и опухолевая ткань молочной железы человека.

Данная дипломная работа посвящена определению состава протеогликанов и экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.


Глава 1. Обзор литературы1.1 Протеогликаны

Протеогликаны (ПГ) - это семейство сложных макромолекулярных соединений, состоящих из белкового кора и ковалентно присоединенных к нему углеводных цепей - гликозаминогликанов (ГАГ) (рис.1).

Рис.1. Структура протеогликана аггрекана

1.2 Отличие протеогликанов от гликопротеинов

Еще недавно бытовало общепринятое разделение: гликопротеин - гликозилированный белок, протеогликан - углеводная молекула с небольшой белковой частью. Это разделение слишком неопределенное.

Существуют более четкие отличительные параметры, позволяющие выделить портеогликаны в обособленный класс белково-углеводных молекул.

Протеогликан - это гликопротеин, к которому присоединены углеводные цепи ГАГ. Гликозаминогликаны являются регулярными (повторяющиеся дисахаридные единицы), неразветвленными, высокозаряженными полимерами. Они присоединяются к коровому белку через кислород остатков серина (за некоторым исключением) - О-гликозилирование. В то время как гликопротеины, к которым относится большинство белков, модифицированы углеводными цепями, не имеющими регулярного строения, эти цепи зачастую не являются линейными (имеют ветвления) и либо состоят из нейтральных моносахаров, либо несут незначительный заряд. Олиго - или полисахаридные цепи в гликопротеинах присоединяются к полипептидным цепям через кислород остатков серина или (чаще) азот остатков аспарагина (О - или N-гликозилирование).

К тому же цепи ГАГ значительно превосходят по длине углеводные цепи гликопротеинов. Например, цепь ГАГ с молекулярным весом 20 кДа содержит около 50 остатков сахаров, в то время как типичный N-гликан содержит 10-12 остатков.

Протеогликаны могут нести на своем коровом белке помимо ГАГ-цепей также короткие нерегулярные олигосахариды. При этом свойства сложной молекулы определяются в основном типом ГАГ-цепи, хотя олигосахариды могут также влиять на биологическую активность.

Если к гликопротеину присоединена хотя бы одна цепь ГАГ, он является протеогликаном.

1.3 Классификация протеогликанов

Классифицируют протеогликаны по типу доминантных цепей ГАГ, присоедненных к коровому белку.

1.4 Строение и классификация гликозаминогликанов

Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахариды, составленные из повторяющихся дисахаридных единиц, каждая из которых состоит из гексозамина (D-глюкозамина - GlcN или D-галактозамина - GalN), соединенного с гексуроновой кислотой (D-глюкуроновой - GlcUA, или L-идуроновой - IdоUA), присутствующей во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (Gal).

Дисахаридные единицы могут быть N - и O-сульфатированы и/или ацетилированы. Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3-4 сульфатных групп на дисахарид.

Благодаря сульфатным и карбоксильным группам ГАГ имеют очень высокую плотность отрицательного заряда, что во многом определяет их биологические свойства и регулирует их взаимодействие с другими молекулами.

В зависимости от структуры дисахарида, а также степени сульфатирования, все ГАГ разделяют на несколько классов: гиалуроновая кислота (ГК), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), гепарансульфаты (ГС), гепарин (Ге), кератансульфаты (КС) (таблица 1 и рис.2). Зачастую на одном белковом коре находятся разные типы ГАГ-цепей.

Таблица 1. Классы гликозаминогликанов (ГАГ)

Класс ГАГМол. Вес, кДаПовторяющаяся дисахаридная единицаСульфогруппа (O-, N-связанная)Количество сульфо-групп на 1 дисахаридДругие сахара, встречаю-щиеся в связующем участке
Гиалуроновая кислота, ГК1-8000

D-GlcUA,

D-GlcN

---

Хондроитин-

сульфат, ХС

10-50

D-GlcUA,

D-GalN

O-0,1-1,3D-Gal, D-Xyl
Дерматан-сульфат, ДС10-40

D-GlcUA/

L-IdоUA, D-GalN

O-1-2,5D-Gal, D-Xyl
Гепаран-сульфат, ГС10-40D-GlcUA/L-IdоUA, D-GlcNO-, N-0,4-2,0D-Gal, D-Xyl
Гепарин, Ге5-25D-GlcUA/L-IdоUA, D-GlcNO-, N-1,5-3,0D-Gal, D-Xyl
Кератан - сульфат I, KC I5-25D-Gal, D-GlcNO-0,9-1,8D-Man, L-Fuc, SA
Кератан - сульфат II, KC II5-15D-Gal, D-GlcNN-0,9-1,8D-GalN, SA
Актуально: