Геномика как научная дисциплина

1. Задачи и цели геномики. Взаимосвязь геномики и протеомики

2. Виды геномики

3. Секвенирование генома

4. Проект "Геном человека"

5. Генотерапия

Заключение

Список литературы

Успехи генетики, молекулярной биологии и биохимии привели к формированию в 1990-х гг. двух новых фундаментальных дисциплин — геномики и протеомики. Бурное развитие этих дисциплин обеспечивает в наше время прогресс в ряде разделов биотехнологии, в том числе фармацевтической.

Термин "геномика" производный от генома — совокупности всех генов организма; — "протеомика" — производный от протеома — совокупности структурных и каталитических белков в клетке укариота или прокариота. Обе дисциплины можно считать как бы терминологическим оформлением современного этапа развития генетики и белковой химии, приближающим их к целостной клетке. И по времени возникновения, и в методологическом аспекте главенствующее значение здесь занимает геномика; протеомика базируется на геномике, являясь этапом познания живого уже на белковом уровне.

Генетика начала XIX в. получила позднее название формальной, поскольку исследования велись на уровне "ген-признак" (открытие знаменитых основополагающих законов Г. Менделем). Существование гена было постулировано, но материальная его природа оставалась неизвестной. Лишь в 1950-е гг. после появления и быстрого подтверждения справедливости концепции о двойной спирали ДНК и о гене как участке ДНК, началось бурное развитие молекулярной генетики: были установлены размеры отдельных генов, функциональные участки в гене и т.д. Параллельно биохимиками с участием генетиков был установлен матричный механизм белкового синтеза с передачей генетического кода от ДНК к белку.

1. Задачи и цели геномики. Взаимосвязь геномики и протеомики

Задача геномики — установление полной генетической характеристики всей клетки — количества содержащихся в ней генов и их последовательности, количества нуклеотидов в каждом гене и их последовательности, определение функций каждого гена по отношению к метаболизму организма или, более обще, применительно к его жизнедеятельности.

Геномика позволяет выразить сущность организма — его потенциальные возможности, видовые (и даже индивидуальные) отличия от других организмов, предвидеть реакцию на внешние воздействия, зная последовательность нуклеотидов в каждом из генов и число генов.

Цель геномики — получение информации обо всех потенциальных свойствах клетки, которые не реализуются на данный момент, например, "молчащие гены", протеомика же дает возможность охарактеризовать клетку в данный момент, зафиксировав все находящиеся в ней белки в своего рода "моментальной фотографии" функционального состояния клетки на уровне ее протеома, т.е. совокупности всех ферментных и структурных белков, которые "работают" в отличие от неэкспрессирующихся генов.

При этом, если геномика появилась прежде всего в результате развития техники секвенирования, то для протеомики такую же основополагающую роль играет техника двухмерного электрофореза — разделения белков в одном направлении по молекулярной массе, а в другом — по изоэлектрической точке. Сам по себе этот метод не нов, однако он в значительной мере усовершенствован, что позволяет следить в динамике за сотнями белков одновременно.

Протеомика позволяет следить за белковыми взаимодействиями. Это относится, например, к передаче сигналов от поверхности клетки к факторам избирательной транскрипции в ядре. С ее помощью может быть преобразована, таким образом, не только технология скрининга иммуносупрессоров, но и ингибиторов сигнальной трансдукции в целом. Методы протеомики позволяют получить более полную, всестороннюю картину взаимодействия с клеткой новых потенциальных антимикробных агентов. Работы по изучению динамики биосинтеза ферментов вторичного метаболизма у микроорганизмов при использовании протеомики могут быть переведены на новый, более высокий уровень.

Возвращаясь к связи протеомики с геномикой, следует подчеркнуть, что протеомика может быть названа продолжением именно функциональной геномики. В отличие от геномики предметом изучения протеомики являются продукты, кодируемые генами, экспрессирующимися в данный момент.

Минимальные геномы микроорганизмов некоторых видов состоят из нескольких сотен генов. Геном человека приближается к ста тысячам генов. Размеры отдельных генов варьируют примерно от одной тысячи пар нуклеотидов и выше. Таким образом, количество пар нуклеотидов, составляющих индивидуальный геном, измеряется как минимум сотнями тысяч, обычно же многими миллионами пар нуклеотидов.

Следовательно, для полного знания генома организма надо определить последовательность нескольких миллионов пар нуклеотидов (А-Т — аденин-тимидин, Г-Ц — гуанидин-цитозин). Провести "секвенирование", согласно вошедшему в употребление выражению, целого генома можно только при наличии высоких технологий и соответствующего оборудования.

В настоящее время в качестве ежесуточного итога работы многих десятков лабораторий в разных странах мира секвенируется приблизительно один миллион пар нуклеотидов. Хранить же полученные данные и пользоваться ими невозможно без обращения к специальным базам данных, некоторые из которых имеют статус международных. Широкую известность имеют базы данных института геномных исследований (США) и Гейдельбергского университета (Германия). Международные базы данных позволяют получать сведения о гене и его распространенности среди патогенов; о кодируемом этим геном продукте и об участии этого продукта (как правило, фермента) в том или ином метаболическом цикле; о катализировании им конкретной реакции в цикле. Иными словами, исходным тест-объектом для отбора антимикробных веществ, избирательных ингибиторов метаболизма становится уже не микробная культура, а ген (точнее, кодируемый им продукт).

Необходимо иметь в виду, что различие по последовательности нуклеотидов геномов разнообразных организмов не обязательно указывает на межвидовые различия; например, у микроорганизмов, используемых в качестве продуцентов в биотехнологической промышленности, зафиксированы различия в геномах у отдельных штаммов одного и того же вида. Внутривидовые различия в геномах могут обнаруживаться по всей лестнице живых существ, исключая человека (в последнем случае индивидуальные различия, выявляемые при анализе ДНК, составляют, в частности, новый эффективный прием судебной экспертизы).

2. Виды геномики

Геномика дифференцируется по нескольким направлениям:

1) Структурная геномика, задачей которой является идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ (ведется поиск открытых рамок считывания со старт и терминирующими кодонами). В результате изучаемый геном характеризуется по молекулярной массе, количеству генов и нуклеотидной последовательности в каждом гене; у прокариот — в геноме хромосомы, у эукариот — в каждой из хромосом.

2) Сравнительная геномика позволяет: относительно быстро, связавшись с базой данных и, получив ответ на свой запрос, установить, является ли изученный по последовательности нуклеотидов ген уникальным, или он уже был идентифицирован в другом лаборатории, получить сведения о степени гомологии родственных генов, т.е. степени гомологии по последовательности нуклеотидов в открытой рамке считывания; ответить на вопрос об эволюционной близости одного организма другому и на ряд подобных вопросов, относящихся к фундаментальной биологии.

В сравнительной геномике заложены возможности ответа и на вопросы практического характера. Например, если ведется поиск ингибиторов данного гена у патогенного микроорганизма с целью создания на их основе лекарственных средств, то важно знать, есть ли ген с такой или близкой последовательностью нуклеотидов в организме хозяина. Это позволяет сделать прогноз о степени безопасности создаваемых лекарств.

3) Функциональная (метаболическая) геномику. Ее цель — установление связи между геномом и метаболизмом, кластерами генов и многоступенчатыми метаболическими процессами, отдельными генами и конкретными метаболическими реакциями. Применительно к функциональной геномике относится понятие так называемых "модельных" организмов: прежде всего, это некоторые микроорганизмы, у которых прослежены связи между генами и кодируемыми этими генами ферментными и структурными белками, т.е. прокариоты и низшие эукариоты с полностью секвенированным геномом и досконально изученным метаболизмом.

Примерами таких модельных микроорганизмов могут служить Escherichia coli (у прокариот) и Sacsharomyces cerevisiae (у эукариот). Сопоставление гена у изучаемого организма с близким по степени гомологии геном у модельного организма позволяет предположить функции гена. Отсутствие гомологии указывает на необходимость специального изучения функций нового гена.

Особое значение применительно к фармации функциональная геномика имеет при установлении так называемой "существенности" отдельных генов. Под "существенностью" подразумевается необходимость гена для жизнедеятельности клетки. Так, при создании антимикробных лекарственных препаратов именно "существенные" гены должны быть мишенями для антимикробных веществ. Отметим, что иногда ген приобретает значение "существенности" только в особых условиях, в которых может оказаться патогенный микроорганизм.

Исходя из размеров генома и количества генов понятно, что задача полного секвенирования генома решается быстрее в случае микроорганизмов в отличие от высших эукариот. К настоящему времени полностью секвенирован геном нескольких десятков видов бактерий, в том числе патогенных. У разных видов бактерий размер генома варьирует, но в целом он близок к нескольким тысячам генов или нескольким миллионам пар оснований соответственно.

В клинике в настоящее время используется порядки двухсот природных и синтетических антибактериальных веществ. Каждое из них имеет свою мишень. Как правило, это или фермент, или рибосомный белок. Всего реализованных мишеней также около двухсот. Следовательно, подавляющее количество генов в качестве мишеней для антибактериальных агентов все еще не используется. Для доказательства "существенности" генов применяется метод избирательного "выбивания" гена из генома с проверкой выживания организма после такой процедуры, который представляет большой интерес как технология скрининга антибактериальных (или шире — антимикробных) агентов.

Традиционно первичный отбор последних проводится путем испытания их действия на рост тест-культуры микроорганизма. Высокоактивные, подавляющие рост (природные или синтетические) вещества, отобранные на этом этапе, проходят дальнейшие испытания, в частности определяется антимикробный спектр их действия и активность в опытах in vivo на лабораторных животных, а также токсичность как для макроорганизма в целом, так и для его отдельных органов и тканей.

По завершении доклинических испытаний в случае получения положительных результатов ставится вопрос о передаче препарата в клинику. Затем, как правило, начинается углубленное изучение механизма действия антимикробного агента на субклеточном и молекулярном уровнях, т.е. ведется поиск его внутриклеточной мишени — макромолекулы или макромолекулярного комплекса — таргета (англ. мишень) по недавно принятой терминологии. Далее выявляется ген, кодирующий образование этой макромолекулы, или гены, которые кодируют образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.

По новой технологии скрининга (в отличие от вышеуказанной) используют информацию о полностью секвенированном геноме патогена и наличии в нем "существенных" генов. В лабораториях, работающих в области создания новых антимикробных лекарств, предварительно выбирается ген, который будет использован для их испытания как таргет (точнее, в качестве мишени будет использован продукт этого гена).

Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена отбирать биологически активные вещества с запланированным механизмом действия (в отличие от традиционного метода, когда поиск ведется "от клетки к гену"). Первый этап таргетного скрининга начинается с выделения этого гена (соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Далее, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), фрагмент ДНК амплифицируется (создается вирусный вектор, который вводится в плазмиду). Количество копий гена умножается. Затем конструируются:

• бесклеточная система, где наработанная матрица служит для получения информационной РНК, специфичной для гена;

• бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукта, кодируемого данным геном.

Бесклеточная система, используемая для первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ — ингибиторов фермента (продукта изучаемого гена), содержит как фермент, так и его субстрат. Когда наработан белок (продукт избранного для изучения гена), тогда возникает вопрос: как узнать функцию этого белка? Например, какую реакцию он катализирует как фермент, чтобы по подавлении этой реакции отобрать ингибиторы. При близком сходстве этого белка с белком из "модельного" организма подобрать бесклеточную систему (субстрат для нового белка) нетрудно. Если сходство есть, но не очень близкое, то прибегают к анализу "мотивов" — коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине белковой цепи и могут оказаться сходными у двух белков.

Когда такого сходства нет или сходство обнаружено, но нет ясности в функции самого гомолога, т.е. белка, взятого для сравнения, прибегают еще к одному способу: устанавливают, с какими белками он контранскрибируется (переписывается в последовательность матричной информационной РНК). Если транскрипт — часть полицистронной (эквивалентной гену) информационной РНК, необходимой для протекания в последующем определенного метаболического процесса с участием нескольких ферментов, тогда поиск функции изучаемого белка, включенного в группу этих ферментов, сужается.

В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых генов многочисленны, и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, в конечном счете, проводить серийные испытания потенциальных ингибиторов функций почти любого из тысяч генов, составляющих геном патогена и обнаруживать все возможные "уязвимые точки" микробной клетки. Подобный путь достижения цели породил в литературе термин "обратная генетика", означающий ведение исследования не от клетки и ее фенотипа к гену, а, наоборот, от гена к клетке и к ее фенотипу.

Полное секвенирование генома в сочетании с применением методов генетической инженерии вносит свой вклад в фармацию еще в одном отношении. У патогенных микроорганизмов открыты гены, "существенные" для протекания инфекционного процесса, но "несущественные" при росте in vitro — на искусственных питательных средах. В последнем случае они ускользают от внимания исследователя, не поддаются идентификации и не могут быть использованы как таргеты при поиске лекарств. Скрытые или по образному выражению "молчащие" in vitro гены патогенных микроорганизмов получили название ivi генов (генов вирулентности), несмотря на то, что в их число входят не только гены, кодирующие образование токсинов, адгезинов и других факторов вирулентности. К ним относят также гены ферментов и транспортных белков, позволяющих патогенной микробной клетке жить и размножаться в тканях макроорганизма в условиях дефицита некоторых органических веществ и неорганических ионов.

4. Проект "Геном человека"

Полное секвенирование генома человека (несколько миллиардов пар нуклеотидов и идентификация генов всех сорока восьми хромосом) — задача качественно более трудная, чем секвенирование генома прокариот и низших эукариот. В начале 1990-х гг. был обнародован Международный проект "Геном человека", целью которого было решение указанной выше кардинальной проблемы с привлечением сил и средств ряда стран, в том числе и России. В 2003 г. этот проект был успешно завершен. Ученые описали все 25 000 генов, присутствующих в хромосомах каждой клетки. За это время были созданы базы ДНК из образцов генов десятков тысяч людей.

В ДНК генома человека обнаружены многочисленные некодирующие последовательности. Вначале к ним прилагалось условное определение "мусор", под которым подразумевались "отходы—излишки, накапливающиеся по мере эволюции генома". Однако в настоящее время обнаружено, что некодирующие последовательности в геноме человека не случайны. Любопытные факты установлены в последние годы при сопоставлении генома человека и человекообразных обезьян. Ожидалось, что эти различия по сравнению с парадигмой дарвинизма о том, что "человек произошел от обезьяны", окажутся довольно значительными и что наш общий предок весьма отдален от нас, а дивергенция произошла очень давно.

Однако это сходство оказалось весьма близким, увеличивая количество загадок. К их числу относится постоянное присутствие в геноме человека последовательностей вирусного происхождения (своего рода "насыщенность" генома современного человека молекулами вирусных ДНК).

Также было обнаружено отличие между геномами представителей разных наций. Это очень деликатный вопрос, учитывая еще совсем недавние трагические страницы истории человечества. Тем не менее закрывать глаза на объективные факты из-за несовершенства человеческого общества было бы неразумно, тем более что познание собственного генома дает человечеству в новом тысячелетии предпосылки для своего совершенствования, над которыми не довлеют ни религиозные догмы, ни разрушительная революционная демагогия.

5. Генотерапия

Сравнивая гены, ученые смогут выявить связи разных генетических вариаций и мутаций со всевозможными заболеваниями.

Прогресс в познании человека привел к возникновению такого важного практического приложения геномики к медицине, как генотерапия. С ее помощью можно лечить многие наследственные заболевания, которые дифференцируются на моно- и полигенные.

Моногенные заболевания на молекулярном уровне сводятся к дефекту какого-либо одного белка в клетке — фермента транспортного или структурного белка. Во-первых, белка может не хватать, а, во-вторых, его функции могут быть нарушены. Так, мутация, в результате которой изменяется активность того или иного фермента, может приводить или к накоплению токсичного субстрата, или к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки; мутация в гене, кодирующем структурный белок, — к серьезным нарушениям клеток, тканей или органов.

Кроме того, мутация в гене, экспрессирующемся в одной ткани, может сказаться самым серьезным образом на другой ткани и привести к появлению множества симптомов. Например, мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, в результате которой блокируется превращение фенилаланина в тирозин, приводит к повышению уровня эндогенного фенилаланина в крови, неправильному формированию миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток ЦНС и, как следствие, — к тяжелой умственной отсталости.

Полигенность заболевания означает, что несколько белков в клетке обладают теми или иными дефектами. В каждой ткани организма экспрессируется свой набор из всей совокупности генов, но есть мутации, которые приводят к болезням, затрагивающим буквально все органы и ткани: мышцы, глаза, печень, кости, сердце и т.д. Отметим, что такие болезни, как рак и гипертония считаются полигенными. Некоторые ненаследственные и инфекционные болезни, в частности вирусной этиологии, также причисляются к полигенным.

Вполне естественно, что проведение генотерапии при моногенных заболеваниях показывает лучшие результаты. При этом ген, с которым ведется работа, должен быть не только картирован, но и идентифицирован (должна быть известна его функция). К настоящему времени картировано около одной тысячи генов, включенных в процесс возникновения и развития моногенных наследственных заболеваний, из которых идентифицировано всего несколько сотен.

При генотерапии требуются предварительное создание рекомбинантной генетической конструкции с нормальной "здоровой" копией дефектного гена, а также создание для этой конструкции вектора, переносящего ее в клетки организма. Для нормального функционирования гена необходимы специфические для каждого гена цис- и трансрегуляторные последовательности. Первые (цис) локализованы в той же хромосоме и могут быть непосредственно сцеплены с геном или находиться на некотором расстоянии от регулируемого ими гена, выступая в качестве промотора; нюрые (транс) располагаются в других хромосомах.

Методы введения генов в клетки-мишени при генотерапии весьма разнообразны, но в большинстве случаев недостаточно эффективны. Это связано с встраиванием чужеродной ДНК в геном только небольшого процента клеток ткани, а также с разрушением ее нуклеазами и т.д. Обнадеживающие результаты получены при использовании генов, "упакованных" в липосомы.

В настоящее время наиболее перспективным путем переноса генов при генотерапии является включение их в векторы, построенные на основе ретро- или аденовирусов. Конечно, здесь прежде всего возникает вопрос о безопасности подобных векторов. Вирусы генетически модифицируются так, чтобы при сохранении способности проникать в клетку они теряли бы способность к автономной репликации.

Для направленной доставки сконструированной последовательности учитывается различный тропизм разных вирусов к определенным видам тканей. Так, представители аденовирусов высокотропны в отношении клеток эпителия дыхательных путей, вирус герпеса высокотропен в отношении нейронов ЦНС и т.д. В перспективе планируется проводить генотерапию с помощью целых рекомбинантных хромосом, что позволяет оперировать рядом генов и их регуляторных последовательностей одновременно.

Современная генотерапия направлена только на соматические, а не на половые (зародышевые) клетки.

Генотерапия ех vivo (вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Исправленные клетки наращиваются и вводятся пациенту трансфузией или трансплантацией. При этом рекомендуется использовать клетки именно от этого больного и их "исправленное" потомство возвращать ему же, что снимает проблему отторжения клеток за счет врожденного иммунитета. Тем не менее использование только аутологичных клеток сужает возможность генотерапии, поэтому разработаны разные методы защиты от иммунного ответа и неаутологачных клеток, которые включают, в частности, применение иммуносупрессоров.

При генотерапии in vivo доставка нормального гена осуществляется непосредственно в ткани человека (в клетки определенных тканей). При этом промотор гена должен быть трансспецифичен.

Перечень наследственных болезней, связанных с недостаточностью того или иного фермента, возрастает по мере раскрытия их биохимического механизма. Соответственно и подходы к реализации теоретических возможностей генотерапии привлекают все большее внимание и конкретизируются. В качестве примера можно привести использование генотерапии в лечении муковисцидо-за. Ген муковисцидоза — муковисцидозный трансмембранный регулятор (МТР) кодирует мембранный белок — муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости (МТРП). Основная функция МТРП — создание регулируемого циклическим 3,5-аденозинмонофосфатом (цАМФ) хлорного канала. Мутации в гене ведут к изменению количества или структуры данного белка, что нарушает транспорт ионов хлора и воды через мембраны клеток эпителия ряда органов. Выделяемая при этом экзокриновыми железами слизь обезвоживается, и вязкость ее повышается. Это приводит к воспалению и размножению инфекционных агентов (вторичная патология). При муковисцидозе наиболее сильно поражаются легкие (бронхи).

Предпосылками для применения генотерапии при муковисцидозе послужили положительные результаты, полученные на клеточных культурах. Введения только одной копии нормального гена в клетку с дефектным геномом было уже достаточно для нормализации ионного транспорта. Еще более обнадеживало, что достаточно было "исправить" 10 % общего числа клеток в монослое, чтобы добиться нормализации транспорта хлора во всем монослое (вероятно, за счет обмена ионами между соседними клетками). Оказалось, что особенно строгая регуляция функций нормального чужеродного гена, кодирующего белок МТРП, не нужна: этот белок (при его избыточном синтезе) не токсичен.

После подробных доклинических исследований генотерапия муковисцидоза была апробирована в клинике. Нормальный ген в составе модифицированных аденовирусов доставлялся в клетки эпителия легких с помощью липосом. Однако результаты генотерапии в клинике оказались не столь блестящими: из нескольких сотен случаев только отдельные опыты оказались удачными. Тем не менее сам по себе переход от экспериментов в области генотерапии муковисцидоза к клинике является большим успехом.

Заключение

Генотерапия постепенно начинает привлекать все большее внимание научно-популярных изданий и СМИ. Несколько десятков технологий генотерапии разных заболеваний прошли апробацию на тысячах больных и добровольцах в США, Англии, Франции и других странах. В ряде клиник испытания прошли благополучно. Первая фаза клинических испытаний, как известно, направлена на проверку безопасности нового средства (метода) лечения. Имеются сообщения о нескольких случаях возникновения лейкемие-подобных заболеваний после клинической апробации некоторых технологий генотерапии. Отмечается, что во всех таких случаях использовались векторы на основе ретровирусов. Сообщается также об отдельных случаях, когда введенный ген экспрессировался не столь длительно, как было запланировано.

Однако несмотря на то, что первые испытания в клинике прошли менее успешно, чем ожидалось на основе данных доклинических испытаний, а применение некоторых видов технологий генотерапии в их сегодняшнем виде временно остановлено, в целом эти испытания продолжаются и технологии совершенствуются. Тем более что при безнадежном состоянии больного врач с согласия или по требованию последнего может проводить испытания технологий даже при определенных сомнениях, возникших в ходе их доклинической апробации.

1. ru.wikipedia.org/wiki/

2. www.biotechprogress.ru

3. www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/what.htm

4. www.old.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl?sid=1280

5. www.oxbow.ru/?page_id=213

6. Елинов Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – 600 с.

7. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии / под ред. С.Г. Инге-Вечтомова. – Л.: Наука, 1986. – 143 с.

8. Северин С.Е. Биохимия и медицина – новые подходы и достижения / С.Е. Северин. – М.: Русский врач, 1998. – 94 с.