Влияние гипотермии на экспрессию генов
Количественные и качественные преобразования белков растений при снижении температуры предполагают индукцию или репрессию их синтеза. Необходимые доказательства правомерности такого заключения были получены при изучении отдельных стадий белкового синтеза. Первая из них - транскрипция.
1. Изменения в содержании нуклеиновых кислот при гипотермии
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что, по сравнению с нормальными условиями, содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно. Исследование возможности синтеза нуклеиновых кислот в ядрах клеток скерды волокнистой и триллиума во время охлаждения до температур, близких к 0°С, показало, что в этих условиях идет активное включение меченых соединений. Включение метки становилось значительно интенсивнее при небольшом повышении температуры, либо при увеличении экспозиции. Цитофотометрический анализ содержания ДНК-фуксина в корневой меристеме семян озимых злаков показал, что охлаждение снижает репликативную и метаболитическую активности хроматина. Способность хроматина поддерживать синтез РНК даже в присутствии эндогенного источника РНК-полимеразы заметно подавляется при охлаждении бобов. Возможно, это связано с тем, что при снижении температуры уменьшается доступность матрицы ДНК для полимеразы.
В дальнеших исследованиях было подтверждено положение о том, что содержание ДНК при гипотермии изменяется мало, а все изменения в метаболизме нуклеиновых кислот касаются, в основном, РНК. Показано, что низкотемпературная акклиматизация сопровождается увеличением содержания РНК, расхождения в данных о метаболизме ДНК, по-видимому, зависят от того, вычисляется ли содержание ДНК на единицу сырого или сухого веса. В некоторых случаях отмечаются связанные с гипотермией изменения в содержании транспортных РНК, однако эти изменения наблюдались не всеми авторами. Кроме того, имеются данные об изменении активности тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы во время закаливания растения, что свидетельствует о регуляции в этих условиях синтеза белка на уровне трансляции.
2. Изменения экспрессии генов при гипотермии
Как известно, в клетках растений, насекомых, млекопитающих как тепловой, так и холодовой шок вызывает изменения в активности генов. При этом начинается синтез небольшого числа «белков теплового шока» и прекращается синтез всех остальных белков. Если продолжить аналогию между тепловым и холодовым шоками, то следует ожидать, что при понижении температуры в определенных границах начнут функционировать специфические гены. В этой связи становится понятной противоречивость данных об изменении содержания РНК при гипотермии. Значительная часть авторов указывает, что во время охлаждения и холодового закаливания у растени повышается общее содержание РНК, но имеются и противоположные результаты. Изучение специфических видов РНК после фракционирования показало относительное повышение содержания РНК, действующе на уровне трансляции. Низкотемпературное закаливание растения приводит к структурным изменениям в рибосомах.
Ч. Гай с соавторами привели прямое доказательство того, что гипотермия индуцирует изменения в экспрессии генов. Используя трансляцию в бесклеточно системе, они показали, что под действием низких положительных температур происходит быстрое и стабильное изменение набора поли+мРНК, выражающееся в появлении специфических РНК холодового стресса. Изменение набора поли+мРНК происходило уже в первые сутки закаливания, при этом начиналось развитие холодоусточивости,. С началом развития устойчивости коррелировало появление двух мРНК, которые в бесклеточно системе определяют синтез белков холодового шока с молекулярными массами 82 и 180 кДа. В последующие 8 суток продолжается изменение состава мРНК: содержание четырех мРНК увеличивается, а трех - значительно уменьшается. Большая часть белков, синтез которых индуцировался гипотермие, не идентична по молекулярным массам и pI белкам теплового шока. Таким образом, это сообщение является одним из первых свидетельств существования в растениях белков холодового шока, отличных от белков теплового шока.
Быстрое изменение набора мРНК с началом холодового закаливания было впоследствии подтверждено другими исследователями. Так, было показано, что двухдневная экспозиция проростков люцерны при 40С приводит к резкому увеличению содержания общего количества РНК и к изменению состава транслируемых мРНК. Трансляция in vitro поли+мРНК, с последующим электрофорезом меченых полипептидов, показала индукцию синтеза низко- и высокомолекулярных белков холодового шока. При переносе растений в условия с «нормальной» температурой происходило обратное изменение спектра полипептидов и, следовательно, набора мРНК. Показано, что мРНК, индуцируемые охлаждением, накапливаются с различно скоростью. При трансляции in vitro обнаружены группы белков с различной индукцией синтеза de novo -от 6 до 12 часов, а также белки, содержание которых при холодовом закаливании снижается.
В последующие годы изучение изменений в синтезе РНК при низкотемпературном стрессе привлекло особое внимание исследователе. К настоящему времени выделено и охарактеризовано значительное число мРНК, экспрессирующихся при низкотемпературном стрессе и в процессе адаптации растения к низким температурам. В частности, установлено, что, например, в люцерне во время холодовой акклиматизации накапливаются две мРНК, MsaCiA и MsaCiB, которые кодируют белки, содержащие богатые глицином мотивы. Слитые полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выведенные на основании этих мРНК, продуцировались в E. coli и были использованы для получения антител. Полученные антитела обладали кросс-реактивно специфичностью с растворимыми полипептидами MsaCiA и MsaCiB, соответственно. Эти полипептиды обнаруживались только в верхушках закаленных растений, хотя во время холодовой акклиматизации мРНК для
MsaCiA накапливалась как в верхушках, так и в стеблях. Анализ белков при помощи вестерн-блоттинга показал, что MsaCiA-подобные белки с молекулярными массами 32, 41 и 68 кДа накапливались в клеточных стенках стебле, и один, с молекулярно массой 59 кДа, - в клеточных стенках побегов. Показано, что эта дифференциальная экспрессия включает как транскрипционную, так и посттрансляционную регуляцию. Сравнение, проведенное между шестью сортами люцерны с контрастно морозоустойчивостью, подтверждает то, что способность накапливать до значительного уровня белки, подобные MsaCiA и MsaCiB, может быть связана с устойчивостью растения к низким температурам.
В ходе исследований экспрессии генов при низких температурах было выявлено несколько групп генов, экспрессия которых индуцируется холодовым шоком и адаптацией растения к низким температурам. Далее будут рассмотрены основные семейства таких генов.
3. Семейство генов Wcs 120
Озимые, по сравнению с яровыми злаками, обладают эффективными механизмами акклиматизации, которые позволяют им перезимовывать и выживать при температуре замерзания почвы. Это различие генетически запрограммировано и включает в себя сложную генетическую систему. Чтобы понять характер данной системы и ее регуляцию низкими температурами, были идентифицированы и охарактеризованы гены пшеницы, устойчивой к замерзанию почвы. В ходе этих исследований установлено, что семейство гена wcs120 кодирует группу белков с молекулярными массами от 12 до 200 кД. Как показано при помощи биохимических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических анализов, данное семейство генов, специфическое у Poaceae, весьма многочисленно и координированной регулируется низкими температурами. Более того, накопление белков WCS прямо коррелирует с уровнем устойчивости растений к замерзанию почвы. Эти анализы обнаружили также регуляторны контроль процесса яровизации при экспрессии генов низкой температуры у озимых злаков.
Индуцируемые низко температурой у пшеницы гены семейства wcs120 были картированый с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга на дителоцентрических сериях сорта Chines Spring. Идентифицированные гены были локализованы в длинных участках гомологичных групп 6-х хромосом всех трех геномов гексаплоидной пшеницы. Близкие виды, также несущие A, АВ или D геномы также исследовались с использованием вестерн- и Саузерн-блоттинга с wcs120- зондами и WCS120- антителами. Все близкородственные виды несли один или более геномов гексаплоидной пшеницы и продуцировали 50 кДа белок, реагирующи с антителами и определяемы при помощи вестерн-блоттинга, и wcs120-гомологи, которые определялись при помощи Саузерн-блоттинга во всех видах. Отсутствие участка 6DL хромосомы в гексаплоидной пшенице сорта Chines Spring вызывало отсутствие синтеза 50 кДа белка, что не только указывало на локализацию wcs120 в данном участке 6DL-хромосомы, но также и подтвердило молчание wcs120-гомологов в 6А хромосоме. Были также исследованы содержание белков, реагирующих с антителами на WCS120, и уровни холодоустойчивости в сериях лини с заменой хромосом сорта Chines Spring на хромосомы сорта Cheyenne. В ходе экспериментов было установлено, что 5А хромосома сорта Cheyenne увеличивала холодоустойчивость пшеницы сорта Chines Spring. Денситометрия вестерн-блоттингов для определения содержания белка показала, что хромосома 5А имеет регуляторный эффект на экспрессию гена семейства wcs120, располагающегося на хромосомах 6-о группы всех трех геномов гексаплоидной пшеницы.
4 Специфические для низкой температуры и генных богатых глицином белков
Специфическая для низко температуры кДНК пшеницы pTACR7, представляет ген, определенный как tacr7 из озимой пшеницы. Термин низкотемпературно-специфический используется авторами, поскольку экспрессия гена tacr7 не вызывается обработкой экзогенно абсцизовой кислотой или другими типами стресса, такими, как солевой стресс, обезвоживание и тепловой стресс. PTACR7 был выделен при помощи олигонуклеотидного зонда, сходного с pHVCR8 из ячменя посредством RT-PCR с мРНК из ткани побегов пшеницы. На основании предсказанной аминокислотной последовательности были определены характеристики этого белка. Установлено, что TACR7 очень гидрофобный белок, с единственно трансмембранно областью и богат лейцином. Изучение уровне содержания копи tacr7 показало их накопление в проростках пшеницы, верхушечной ткани и каллусной культуре после переноса объектов из контрольных условий на холод. В ходе экспериментов наблюдалось отсутствие обнаруживаемых нозерн-гибридизацие транскриптов pTACR7 в проростках или каллусах, обработанных экзогенно абсцизовой кислото, после солевого стресса, обезвоживания или теплового стресса. Транскрипты tacr7 накапливались в ткани меристемы во время экспонирования при 20C в больше степени в холодоустойчиво озимо пшенице 16029), чем холодочувствительной 16169) с наибольшим различием между генотипами на третьей неделе закаливания. Таким образом, кодируемы tacr7 белок по своим характеристикам уникален среди описанных в литературе индуцируемых низко температурой белков пшеницы.
При изучении мутации сердцевины пентамера CCGAC двух предполагаемых индуцируемых низко температурой элементов в 5'-области индуцируемого холодом гена BN115 озимого рапса при помощи анализа нерезидентной экспрессии равнодействующих мутированных слияний BN115-промотор-GUS было установлено уменьшение низкотемпературного регулирования промотора. Это указывает на то, что последовательность CCGAC в гене BN115 является чрезвычайно важно для его ответа на низкую температуру. Напротив, мутация двух G-боксов CACGTG, находящихся между индуцируемыми низко температурой элементами в то же области промотора, не изменила индуцируемую холодом экспрессию гена. Замена возможно области энхансера промотора BN115 на энхансер из промотора CaMV 35S выразилась в увеличении уровня низкотемпературно индукции экспрессии GUS.
При изучении кДНК ячменя были получены ген-специфические зонды, кодирующие два типа глицин-богатых белков: HvGRP2, характеризуемы цитокератин-подобно и цистеин-богато областями, и HVGRP3, чья основная особенность - наличие РНК-связывающей области. В ходе исследования было установлено, что экспрессия генов HvGRP2 и HVGRP3, которые присутствуют в одно или двух копиях на кажды гаплоидны геном, была повсеместно, и было показано, что ген HVGRP3 модулируется изменением услови освещения. Холодовое возде ствие также увеличивало уровни содержания мРНК HvGRP2 и HVGRP3.
При изучении действия окружающей среды на экспрессию индуцируемых холодом генов на уровне изменения содержания мРНК и тестировании взаимосвязи экспрессии генов и холодно акклиматизации растений ячменя в фазе третьего и четвертого листа было проведено несколько вариантов опыта. В первом варианте растения были выращены в различных температурных условиях между 20/150C и +4/-40С, во втором варианте растения были перенесены с температуры 20/150C на температуру 6/20C и в третьем варианте опыта растения были выращены в условиях засухи или недостатка питательных веществ. В ходе экспериментов измерялись при помощи метода отрастания морозоустойчивость растений и уровни содержания мРНК для трех индуцируемых холодом генов: blt4.9, blt14 и blt101 из меристематических тканей побегов. Результаты экспериментов показывают, что закаленность растени и уровни экспрессии мРНК генов blt4.9, blt14 и blt101 повышались при более низких температурах роста. В ходе экспериментов было также установлено, что на степень изменения содержания мРНК этих генов в ответ на изменение температуры среды значительное влияние оказывали предшествующие температурные условия и возраст растения. При этом уровень закаленности растений сильно коррелировал с уровнями содержания мРНК этих генов в растениях, выращенных в различных температурных условиях. Эта корреляция не распространялась на растения, подвергнутые действию недостатка питательных веществ или засухи.
При изучении влияния низко температуры на экспрессию генов в Poncirus trifoliata из закаленных к холоду растений были клонированы шесть кДНК, представляющие уникальные индуцируемые холодом последовательности. В ходе экспериментов было обнаружено, что гены pbcorc115 и pbcorc119 принадлежат к одному семейству генов. Данные сиквенса указывают на то, что pbcorc115 и pbcorc119 содержат открытую рамку считывания, кодирующую полипептид с молекулярно массой 19.8 кДа и полипептид с меньшей молекулярной массой 11.4 кДа, соответственно. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности обнаружил три больших повтора в COR19 и только один повтор в COR11. В каждом повторе были выявлены два элемента -Q-кластеризованный тракт и K-богатый мотив. K-богатый мотив был сходен с подобными мотивами у белков класса D-II из хлопка и группы 2 белков LEA. Сериновый кластер, характерный для многих сходных с группой 2 LEA белков, также был найден в этих белках. В то же время было обнаружено, что в них он находился в необычном положении относительно карбокси-конца. В COR19 и COR11 также присутствовал двусторонни мотив основных остатков, сходных с известными ядерными маркерными последовательностями, что позволяет предположить, что члены данного семе ства белков могут иметь ядерную маркерную функцию. В ходе экспериментов авторами была исследована экспрессия мРНК COR19 в ответ на холодовую акклиматизацию, засуху, затопление и засоление. Результаты показали, что экспрессия COR19 в ткани листа индуцировалась в ответ на холодовую акклиматизацию, но подавлялась во время засухи и затопления.
W. Goodwin с соавторами при изучении озимого рапса изолировали кДНК и выделили ген, кодирующий гибридный богаты пролином белок. Предполагаемы белок по структуре является модульным. При анализе его аминокислотной последовательности установлено, что N-терминальная область данного белка имеет свойства сигнального пептида, который может направлять белок в эндоплазматический ретикулум. Последовательность аминокислот от 27 до 287 имеет три области, которые содержат высокие уровни содержания пролина и нескольких других аминокислот, часто встречающихся в богатых пролином белках клеточной стенки. Эти области характеризуются повторяющимся аминокислотным мотивом. С-терминальная область содержит три предполагаемых мембранно-связывающих участка и имеет высокую степень сходства с аминокислотами некоторых разновидностей гибридных богатых пролином белков. На основе этих данных авторы делают вывод, что данный белок секретируется из клетки, размещается в клеточной стенке и заякоривается в плазматической мембране посредством С-терминально области. В ходе экспериментов установлено, что транскрипты, кодирующие данный белок, индуцируются в ткани листа в течение 8 ч обработки холодом и их содержание быстро снижается при возвращении растения к нормальным температурам. В то же время установлено, что транскрипты не индуцируются тепловым шоком, обезвоживанием, экзогенно абсцизовой кислотой или раневым стрессом, тогда как транскрипты контрольного гена B. napus индуцируются обезвоживанием и экзогенно абсцизовой кислотой.
При изучении экспрессии генов кукурузы были выделены кДНК и соответствующий геномный клон члена семейства генов, кодирующих a-субъединицу фактора элонгации трансляции 1. Предсказанная аминокислотная последовательность из 447 остатков прерывается в гене одним интроном. Саузерн-блот анализ показал, что клонированный ген ef1a - один из семейства, состоящего, по меньше мере, из шести генов. Как показал нозерн-блот анализ, содержание мРНК данного белка в листьях кукурузы увеличивается при низко температуре, в то время как в корнях уровень мРНК ef1 о резко уменьшается. Эти результаты показывают, что экспрессия EF1 о дифференцированно регулируется в листьях и корнях во время холодового стресса.
5. Гены дегидринов и гены индуцируемые экзогенной абсцизовой кислотой
Одними из наиболее изученных семейств генов, индуцируемых низко температурой, являются гены дегидринов и гены, индуцируемые экзогенно абсцизовой кислотой. Гены данных семейств к настоящему времени обнаружены практически во всех изученных видах растений - как травянистых, так и древесных.
При селективном исследовании с использованием первичных антител против богато лизином области дегидринов библиотеки кДНК, созданной из закаленных тканей коры персика, было обнаружено, что некоторые клоны обладают высоко степенью сходства с дегидринами. Нозерн-блоттинг с использованием клона 5А показал, что 1,8 kb участок экспрессировался сезонно и в листопадных, и в вечнозеленых генотипах, а также индуцировался водным дефицитом. Вечнозеленые и листопадные генотипы значительно различались как по их способности к холодовой акклиматизации, так и по сезонно экспрессии транскриптов и белков дегидринов. У обоих генотипов максимум экспрессии транскриптов был отмечен зимо и они не обнаруживались в мае - июле. Экспрессия белков была сходна с экспрессией транскриптов, в то же время экспрессия белка в вечнозеленом генотипе значительно увеличивалась после накопления транскриптов. Полученные данные указывают на то, что во время холодовой акклиматизации могут существовать различные уровни регуляции дегидринов. В ходе исследований авторами также был изолирован клон G10a, содержащий полны ген дегидрина, обозначенный ppdhn1. Этот ген кодировал белок из 472 аминокислот с предсказанным размером 50020 Да. Кодируемы белок содержит девять богатых лизином повторов, характерных для дегидринов и два DEYGNP мотива. Генный блот с использованием зонда к клону 5а показал, что в персике имеется один или два высокогомологичных гена.
При изучении белков, экспрессирующихся в ответ на низкие температуры у Brassica napus, был очищен до почти гомогенного состояния рекомбинант из белка BN28 и была определена его структура. Антитетела, полученные против rBN28, были использованы для характеристики рекомбинантного и нативного белков. Похожи на многие другие индуцируемые низко температурой белки, BN28 необычайно гидрофилен и термостабилен настолько, что остается в растворе после кипячения. Иммуноблот-анализ клеточных фракци показал, что BN28 не был ассоциирован с клеточными мембранами и находился исключительно в растворимой фракции клетки. Хотя ранее предполагалось, что BN28-подобные белки из Arabidopsis thaliana должны обладать антифризной активностью, такая антифризная активность не была определена при рекристализации льда с rBN28.
Из библиотеки кДНК, изготовленной из акклиматизированных к холоду этиолированных проростков рапса был изолирован клон, соответствующий регулируемому холодом гену. Анализ последовательности и поиски гомологи показали, что этот ген кодирует белок, гомологичный с ATP-зависимой фосфоенолпируват карбоксикиназой из Saccharomyces cerevisiae,
Trypanosoma, Rhizobium sp., и Escherichia coli. Аналог из B. napus был обозначен как BnPEPCK. Потенциальный ATP-связывающий сайт, существующи во всех белках PEPCK, также обнаруживался и в BnPEPCK. Хотя в ходе исследований и была установлена конститутивная экспрессия BnPEPCK в контрольных проростках при комнатно температуре, было также установлено, что уровень содержания копи его мРНК статистически достоверно повышался при 4 0C и уменьшался до контрольного уровня, когда проростки возвращались на контрольную температуру. Использование антител, полученных против рекомбинантного гистидин-BnPEPCK слитого белка, продемонстрировало, что уровень содержания белка BnPEPCK коррелирует с накоплением транскриптов Bnpepck.
Для экспериментов, имеющих целью понять механизмы развития морозоустойчивости, индуцированной экзогенно абсцизовой кислотой, были использованы культивируемые клетки эмбрионов озимой пшеницы. Культивируемые клетки обрабатывались 50 M абсцизовой кислоты в течение 5 дне при 23 0С для достижения максимального уровня морозоустойчивости. Возросшая морозоустойчивость обработанных экзогенно абсцизовой кислотой клеток была тесно ассоциирована со значительным накоплением в плазматической мембране полипептида с молекулярно массой 19 кДа. 19-кДа полипептидны компонент был выделен путем препаративного гель-электрофореза и далее разделен на мажорную и минорную полипептидную компоненту при помощи Трицин-SDS-PAGE. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность AWPM-19 и при помощи PCR из библиотеки, выделенной из обработанных экзогенно абсцизовой кислотой культивируемых клеток, был выделен клон кДНК, кодирующий 18.9 кДа гидрофобный полипептид AWPM-19, с четырьмя мембранно-связываемыми доменами и щелочной точко pI. Экспрессия мРНК wpm-1 сильно индуцируется обработкой в течение нескольких часов 50 мМ абсцизовой кислоты. Эти результаты показывают, что AWPM-19 должен быть тесно связан с индуцируемым экзогенно абсцизовой кислотой увеличением морозоустойчивости у культивируемых клеток пшеницы.
6. Гены белков, связанных с процессом льдообразования
Установлено, что бактериальный ген, связанны с образованием льда, inaZ при перемещении в трансгенные растения вызывает образование ядер льда. Предварительная инкубация преобразованной ткани растения при температурах около 0 0C существенно повысила активность нуклеации льда в растениях, хотя максимальная активность нуклеации льда была достигнута только после низкотемпературно обработки продолжительностью около 48 часов. Хотя трансгенные растения содержат сходные количества мРНК inaZ как при «нормальных», так и при низких температурах, установлено, что низкие температуры необходимы для накопления белка INAZ. Предлагается, что устойчивость INAZ белка и, таким образом, активность нуклеации льда в трансгенных растениях усиливается при низкотемпературной обработке.
7. Гены, кодирующие белки, связанные с передачей кальциевых сигналов
Вопрос о механизме восприятия и трансформации сигнала в клетках растений к настоящему времени все еще изучен недостаточно. Установлено, что роль вторичного посредника в передаче стрессовых сигналов у различных организмов, в том числе и у растений, играют ионы Ca2+. В клетках растений, не подвергнутых действию стресса, уровень содержания Ca2+ при помощи активных Ca2+-транспортирующих систем поддерживается на низком, наномолярном уровне. Холодовой шок вызывает резкое увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме. На животных клетках во время стресса были показаны активации ионами Ca2+ протеинкиназы С и Ca2+-кальмодулинзависимо протеинкиназы, вызывающие изменения экспрессии генов. Для выяснения роли Ca2^ процессах ответа растения на низкотемпературны стресс и адаптации к низко температуре были проведены эксперименты по изучению влияния хелатора Ca2+ - ЭГТА и блокаторов кальциевых каналов - La3+ и верапамила - на процессы адаптации растени люцерны к холоду. Результаты экспериментов показывают, что ЭГТА ингибирует низкотемпературную адаптацию на 70%, а La3+ и верапамил полностью блокируют развитие процесса низкотемпературно адаптации у люцерны.
Чтобы далее исследовать путь передачи сигнала, который стимулирует ответ на холодовой шок у кукурузы, был выделен кодирующий низкотемпературно-индуцируемую кальций -зависимую протеинкиназу клон кДНК. Эксперименты по изучению динамики ответа на стресс показали, что низкотемпературная индукция Zmcdpk1 предшествует аналогичному показателю для mlip15, другого холодоиндуцируемого гена, кодирующего ДНК-связывающий белок типа ле цин-зиппер, что указывает на то, что Zmcdpk1 может размещаться раньше mlip15 в пути передачи вызванного холодным стрессом сигнала. При этом было отмечено, что уровень mlip15 мРНК в конститутивном состоянии в большой степени возрос после обработки циклогексимидом. Кроме гена mlip15, циклогексимид увеличивает уровни транскрипции двух других индуцируемых низко температуро генов -Zmcdpk1 и Adh1, кодирующего алкогольдегидрогеназу 1. Напротив, экспрессия гена хальконсинтетазы индуцировалась только низко температуро. Аккумуляция транскриптов mlip15 при низких температурах и в ответ на циклогексимид значительно уменьшалась после предварительно обработки хелатором кальция, что позволяет предполагать, что кальций вовлечен в обоих случаях индукции гена mlip15.
После холодового шока усиливается экспрессия TCH-генов из Arabidopsis, которые кодируют калмодулин-связанные белки и ксилоглюкан эндотрансглюканазу. Была исследована возможная роль колебаний во внутриклеточных концентрациях иона кальция Ca2+ в вызванно холодовым шоком экспрессии гена TCH. Для этого у трансгенных растени, несущих ген апоэкворина, был проведен мониторинг содержания Ca2+ с тем, чтобы исследовать необходимость индуцируемого холодом увеличения содержания Ca2+ для экспрессии TCH. Индуцированное холодовым шоком увеличение содержания Ca2+ может быть заблокировано La3+ и Gd3+, предполагаемыми ингибиторами Ca2+-канала в плазматической мембране, и 1.2-бис этан-н,н-тетраацетиловой кислотой, внеклеточным хелатором Ca2+. В ходе экспериментов было установлено, что индуцируемая холодовымшоком экспрессия TCH генов затормаживается высокими уровнями содержания всех этих агентов, что, как было показано, блокирует увеличение содержания Ca2+. Эти данные подтверждают то, что внутриклеточное увеличение содержания Ca2+, следующее за холодовым шоком, требует внеклеточного Ca2+ и может получить необходимы приток Ca2+ опосредованно через Ca2+ каналы плазмалеммы. Во-вторых, результаты экспериментов свидетельствуют, что индуцируемая холодом экспрессия хотя бы подкласса TCH-генов требует увеличения содержания внутриклеточного Ca2+.
8. Гены белков холодового шока
Установлено, что у бактерий существует многочисленное семейство генов, экспрессирующихся только в ответ на резкое снижение температуры. Гены этого семейства обозначены как гены белков холодового шока. Показано, что для начала экспрессии некоторых из этих белков холодового шока бактерий достаточно снижения температуры на 10 - 150С.
Известно, что экспрессия гена CspA, важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, очень сильно индуцируется во время резкого снижения температуры. Установлено, что замена трех оснований около последовательности Shine-Dalgarno размером в 159-оснований в 5'-нетранслируемой области мРНК cspA стабилизирует мРНК, приводя к конститутивному синтезу CspA при 370С. Как оказалась, эта стабилизация, по крайне мере частично, происходит из-за сопротивления деградации РНКазо E. Холодовая индукция cspA также достигалась путем замены его промотора промотором Ipp, не индуцируемым-холодовым шоком. Таким образом, полученные данные указывают на то, что ген CspA эффективно транскрибируется даже при 370C. В то же время трансляция мРНК белка CSPA заблокирована вследствие ее предельно нестабильности при 370C. Представленные результаты также демонстрируют, что ген cspA конститутивной транскрибируется при всех температурах; однако его экспрессия при 370C предотвращена из-за дестабилизации его мРНК.
С целью оценить эффективность промоторов белков холодового шока для их низкотемпературно экспрессии, было сконструировано транскрипционное слияние генов между промотором гена cspA и геном бета-галактозидазы lacZ. Показано, что в таком слитом гене синтез бета-галактозидазы эффективно подавлялся при 370C, но быстро индуцировался при переносе в 150C, приводя к трех- пятикратному увеличению в специфическо активности белка относительно контрольно бактериально культуры. Только продолжение инкубации культуры при 200C, но не при 150C, приводило к ослаблению активности из-за деления клетки и репрессии промотора, хотя исходные показатели накопления бета-галактозидазы при 200C были в два раза выше измеренных при 150C.
Из двух штаммов Lactobacillus plantarum были клонированы два гена белков холодового шока, cspL и cspP. Эти гены, являющиеся неаллельными, присутствовали во всех исследованных штаммах. Данные гены кодируют полипептиды из 66-аминокислотных остатков, родственные друг другу и принадлежащие к семейству CSP - «белков холодового шока». Транскрипция гена cspP оканчивается единственной мРНК, в то время как для гена cspL были найдены две cspL мРНК с общими 5' концами. Содержание этих транскриптов умеренно возрастало в ответ на обработку культур холодом.
При изучении ответа лактозно-кислых бактерий на замораживание было установлено, что при замораживании культуры лактозно-кислых бактерий жизнеспособность клеток в значительно мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 100C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis и Pediococcus pentosaceus PO2, но она не менялась у штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris и у штаммов Lactobacillus helveticus LB1 и Streptococcus thermophilus TS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR пра меров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, так и Bacillus subtilis приводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcus lactis ssp. Lactis M474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus или Pediococcus pentosaceus.
9. Гены протеинкиназ
Клон кДНК для гена рецепторо-подобно протеинкиназы был выделен из Arabidopsis thaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторной киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматическо протеинкиназы, который содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизовой кислотой. Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация солей и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефицитных по эндогенно абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой.
10. Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду
Хранение клубне картофеля на холоду при 4 0C связано с
накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованной кДНК был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.
Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsis thaliana. Транскрипты CI7 дифференциальной экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодовой стресс, засуху, высокую концентрацию солей или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне, индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенно абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных воздействи. В ходе экспериментов растения S. tuberosum были трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5'-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубне независимых трансгенных лини не обнаружил значительно индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно-регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля.
Анализ последовательности кДНК клона CI21, который соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата и дикого картофеля, индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и тепловой шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемо области промотора ci21A и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 0C у трансгенных растений наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы.
11. Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции
В ходе исследований экспрессии генов семейства