Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Почва является основным депо разнообразных микроорганизмов на Земле (1;10). Известно, что 60–90 % биомассы Земли представлено микроорганизмами, населяющими, главным образом почву (2), причем их численность в почве, по сравнению с другими природными средами, выше на несколько порядков (3).

Микроорганизмы распределяются по всему почвенному профилю вплоть до подстилающей породы (1;10). Значительный практический и теоретический интерес представляет вопрос о том, как изменяется численность микроорганизмов по почвенному профилю, а также динамка численности микроорганизмов в нижнем почвенном горизонте в силу новизны самой проблемы. Особенно это касается недостаточно исследованных почв, имеющих в своем профиле оглеенные горизонты.

В анаэробных условиях при участии гетеротрофных бактерий, использующих органическое вещество, при постоянном или периодическом увлажнении идет один из интересных почвообразовательных процессов – глееобразование (2;8). Этот процесс сопровождается восстановлением Fe(III) до Fe(II) и выносом Fe(II)-соединений в нижние горизонты почвенного профиля. Глееобразование практически всюду может происходить в результате антропогенной деятельности, если она приводит к переувлажнению почв.

В условиях застойно-промывного режима в результате глееобразования происходит максимальный вынос не только железа, но и других металлов – марганца, алюминия, кальция, магния (8;9). Изучение особенностей микроорганизмов глеевых почв весьма актуально, так как при антропогенном воздействии на почвенный покров, в том числе при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами, подобные почвы встречаются практически повсеместно. В Ярославской области почвы с различной степенью оглеения занимают около 18,3 %, что составляет 662,5 га земель (8).

Почвенные микроскопические грибы и бактерии являются практически единственными деструкторами органического вещества, поступающего в почву в виде растительного опада, мертвых животных, а также органических ксенобиотиков (4;9). Важным микробиологическим показателем состояния почвы является соотношение численности бактерий двух физиологических групп, которые входят в функциональную структуру почвы: сапротрофов и олиготрофов (2;3). Сапротрофы разлагают разнообразные органические соединения в значительной концентрации, попадающие в почву. Олиготрофы способны ассимилировать органические соединения в условиях их низкой концентрации, при этом они разлагают остаточные количества органических соединений, «рассеивающиеся» в почве при деятельности сапротрофов и автохтонных микроорганизмов, разлагающих почвенный гумус (1;3).

Целью работы было изучение динамики численности бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить общую численность бактерий в 5 горизонтах почвенного профиля дерновой альфегумусовой глеевой почвы путем прямого счета по методу Виноградского-Брида.

2. Определить численность сапротрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

3. Определить численность олиготрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

4. Проанализировать полученные данные по общей численности, численности сапротрофов и численности олиготрофов.

1 Материалы и методы исследования

1.1 Объект исследования и подготовка образцов почвы

к микробиологическому исследованию

Объектом исследования служили пять образцов дерновой альфегумусовой глеевой почвы, отобранной в 5 км от поселка Дорожный Ярославского района Ярославской области. Охарактеризуем горизонты по мере увеличения глубины их залегания:

1. почвенный образец взят из темногумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 7 – 12 см, цвет темно-серый, структура зернистая, наблюдается обилие мелких корней;

2. образец взят из горизонта темногумусового с признаками оглеения почвенного разреза. Глубина 12 – 16 см, цвет темно-серый, наблюдаются мелкие серые, рыжие и сизые пятна, в качестве включений представлены мелкие корни, механический состав определяется как среднесуглинистый;

3. образец взят из светлогумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 16 – 23 см, цвет серый, наблюдаются рыжие и сизые пятна, механический состав определяется как среднесуглинистый, структура зернисто-комковатая, в качестве включений представлены мелкие корни;

4. образец взят из иллювиально-гумусово-железистого горизонта почвенного разреза. Глубина 25 – 45 см, преобладающий цвет светло-бурый с многочисленными охристыми, сизыми и голубыми затеками и пятнами; до глубины 45 см заметны затеки гумусового вещества; горизонт плотного сложения, сильно увлажнен; механический состав определяется как легкоглинистый;

5. образец взят из глеевого горизонта почвенного разреза. Глубина 45 – 70 см, цвет темно-серый, присутствуют кирпично-красные включения; горизонт более уплотнен, с глубины 70 см просачивается вода.

Подготовку почвенных образцов проводили согласно существующим рекомендациям (7).

1. Почву высыпали на сухое стекло, тщательно перемешивали и раскладывали ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляли мелкие корешки и другие посторонние включения. Из разных мест рассыпанной почвы отбирали небольшие порции и взвешивали на технических весах по 1 г почвы из каждого горизонта.

2. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц, каждую навеску почвы вносили в отдельную колбу, содержащую 100 мл стерильного физиологического раствора (0,5% раствор хлорида натрия). Колбы встряхивали на качалке в течение 30 минут.

1.2 Определение общей численности бактерий в почве

Общее количество бактерий в почве учитывали прямым счетом на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) (6;7).

1. Пять предметных стекол обезжиривали и на каждом обводили карандашом по стеклу квадрат со стороной 15 мм.

2. Бактериальную суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и равномерно распределяли по площади квадрата.

3. Препараты подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем 2 – 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.

4. Подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп марки «Биолам» с масляной иммерсионной системой при увеличении 10×1,0×100.

Для прямого счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9 маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей зрения.

Общую численность бактерий в 1 г почвы (N_общ.)определяли по формуле:

S × Σn_i

N _общ. = z× ×v×100 (кл/г), где

S – общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм²);

Σn_i – сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;

z – количество просмотренных полей зрения (15);

s – площадь одного поля зрения (1089×10^-6 мм²);

v – объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);

100 – разведение первоначального образца почвы в 100 раз.

Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

Определение количества клеток сапротрофов (N_сапр.)проводили высевом на жидкую питательную среду – мясо-пептонный бульон (МПБ) (6). Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки – 17,9; NaCl – 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди (7).Готовилиряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10^-1 до 10^-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 ⁰С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки (6;7).

Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава (11): Na₂HPO₄ – 0,8 г; KH₂PO₄ – 0,5 г; NH₄Cl – 0,5 г; MgSO₄ – 0,2 г; CaCl₂ – 0,1 г; FeSO₄×7H₂O –15 мг; дрожжевой экстракт – 0,1 г ; пептон – 0,2 г; агар – 15 г; глюкоза – 0,2 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (N_олиг.) определяли методом высева по Коху (7). Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10^-1 до 10^-9.По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ², рассчитываемому по формуле (7):

(n_i–n)²

χ ² =      п ,

где п_i– число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п – их среднее значение.

Различие считается значимым при χ ² не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:

n×r

N_олиг. = v(кл/г),

где п – среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – величина разведения; v – объем образца, посеянного на чашку (мл).

Кроме того, рассчитывали отношение N_сапр. к N_общ. для каждого горизонта.

2 Результаты и обсуждение исследования

Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.

Таблица 1

Общая численность бактерий в почвенном профиле

дерновой альфегумусовой глеевой почвы