Роль карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в гемостазе у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Система гемостаза

1.1.1 Механизмы свертывания крови

1.1.2 Противосвертывающие механизмы и система фибринолиза

1.1.3 Нарушения системы гемостаза у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

1.2 Пептидергическая система

1.2.1 Механизм образования активных форм пептидов

1.2.2 Вазоактивные пептиды и их роль в регуляции гемостаза

1.2.3 Ферменты обмена вазоактивных пептидов

1.2.4 Изменения в пептидергической системе онкологических больных

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материал исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N

2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

2.2.3 Метод определения содержания белка

2.3 Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

3.2 Исследование активности ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

Выводы

Список литературы

Список сокращений

АД – артериальное давление

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

АДФ – аденозин фосфат

АПТВ – активированное парциальное тромбопластиновое время

ВФ – фактор Виллебранда

КПN – карбоксипептидаза N

МФ – мономер фибрина

ПТИ – протромбин

РААС – ренин-ангиотензин-альдостероновая система

РФМК – растворимый фибрин-мономерный комплекс

ТПА – тканевой плазминогеновый фактор

ТФ – тканевой фактор

ХЗФ – Хагеман-зависимый фибринолиз

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

Введение

Онкологические заболевания – тяжелейший недуг, борьба с которым – задача современного общества и вторая по значимости причина смертности во многих странах мира после сердечно-сосудистой патологии (2, 3).

Опухоль оказывает воздействие на все обменные процессы в организме, при этом происходит нарушение гемостаза, несовместимое с жизнью. Современные многоцентровые исследования показали, что риск ранних тромбоэмболических осложнений у онкологических больных в несколько раз выше по сравнению со здоровыми людьми того же возраста. Учащение эпизодов тромбирования возрастает с 6-10 до 35 % (8). Основную роль в патогенезе различного рода тромботических осложнений, диссеминированного внутрисосудистого свертывания у онкологических больных играют изменения системы гемостаза (5), вызываемые как самой опухолью, так и различными методами лечения (19, 26, 27, 35, 37).

В последние годы существенно повысилась эффективность во всех трех направлениях лечения раковых заболеваний: хирургического, химиотерапевтического и радиологического. При этом хирургические вмешательства у больных со злокачественными новообразованиями часто осложняются массивными кровопотерями, что в первую очередь обусловлено травматичностью оперативных вмешательств из-за распространенности опухолевого процесса, при этом усугубляются нарушения гемостаза, патогенетические механизмы которых изучены недостаточно (9, 17, 24, 32, 47, 52, 65) .

В функционировании системы гемостаза немаловажная роль принадлежит вазоактивным пептидам, в обмене которых принимают участие ангиотензинпревращающий фермент и карбоксипептидаза N (48).

Целью настоящей работы было изучение роли карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в гемостазе у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1.Изучить активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента у больных раком легких.

2. Изучить активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента у больных раком брюшной полости.

3. Изучить активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента у больных раком мочеполовой системы.

4. Исследовать корреляционные взаимосвязи между активностью изучаемых ферментов и показателями гемостаза.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучена активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде. Установлены корреляционные взаимосвязи между активностью исследуемых ферментов и показателями гемостаза.

Полученные результаты представляют интерес для понимания роли карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в регуляции гемостаза при онкологических заболеваниях с различной локализацией опухоли и могут быть использованы для разработки методов профилактики и коррекции нарушений гемостаза в послеоперационном периоде.

Апробация работы. Материалы данной работы представлены на 57 научной конференции студентов ПГПУ, направлена статья в журнал «Известия Пензенского государственного университета им. В. Г. Белинского» (2008 г.).

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Система гемостаза

Система гемостаза является одной из защитных систем организма. Она обеспечивает с одной стороны сохранение крови в кровеносном русле в жидком агрегатном состоянии, а с другой стороны остановку кровотечения и предотвращает кровопотери при повреждении кровеносных сосудов. Основными компонентами системы гемостаза являются сосудистая стенка (особенно её эндотелий и субэндотелий), клетки крови, а также плазменные и клеточные ферментные системы: фибринолитическая, антикоагулянтная, калликреин-кининовая (36).

1.1.1 Механизмы свертывания крови

Сосудисто – тромбоцитарный (первичный) гемостаз

Стенка капилляра образована эндотелием, базальной мембраной и адвентицией.

Базальная мембрана капилляра состоит из аморфного вещества, представленного в основном гиалуроновой кислотой и коллагеновыми волокнами.

В синтезе гиалуроновой кислоты принимают активное участие катехоламины (адреналин, норадреналин), витамины С, Р, ионы Са²⁺, глюкокортикоиды. При достаточном количестве этих веществ создается структурно и функционально полноценная сосудистая стенка. Функциональная полноценность сосудистой стенки и эндотелия проявляется прежде всего в скорости их сокращения в ответ на травму и способности противостоять механическому воздействию. Это – первая и самая быстрая первичная реакция гемостатической системы (25).

В капиллярах и других сосудах микроциркуляторного русла сосудистый спазм, значительно снижающий объем кровопотери, длится 2-3 минуты, затем наступает дилатация поврежденного сосуда. Вследствие этого должно было бы возобновиться кровотечение. В норме этого не случается, так как сосудистый компонент гемостаза подкрепляется тромбоцитарным.

Уже в первые секунды после травмы происходит адгезия (прилипание) тромбоцитов к краям поврежденного эндотелия и коллагеновым волоконцам. Под влиянием АДФ, которая выделяется из поврежденного сосуда и при гемолизе эритроцитов, тромбоциты склеиваются друг с другом (наступает их агрегация) как у места поврежденного сосуда, так и в кровотоке. В результате адгезии и начальной агрегации тромбоцитов из них выделяются серотонин, адреналин и АДФ (собственная АДФ тромбоцитов). Это – реакция освобождения первого порядка. АДФ способствует агрегации пластинок, а серотонин и адреналин усиливают сокращение поврежденной сосудистой стенки (28).

Адреналин и АДФ, а также находящиеся в плазме Са²⁺, Mg²⁺, фибриноген и другие плазменные факторы усиливают агрегацию тромбоцитов. Однако эта реакция обратима у большинства пластинчатых агрегатов. Прилипая друг к другу и к адгезированным тромбоцитам, они все же могут отрываться и уноситься в кровоток. Таким путем идет дезагрегация, скорость которой также во многом определяет наклонность к кровоточивости или тромбообразованию.

Наряду с процессами адгезии и агрегации тромбоцитов из поврежденных тканей и эндотелия выделяется тканевый тромбопластин (IП фактор свертывания). При его взаимодействии с VП, IV, Х и V факторами, а затем и с протромбином (фактором П) образуется тромбин. Следов тромбина недостаточно для свертывания крови, но благодаря ему начинаются важные реакции первичного гемостаза: тромбин действует на агрегаты тромбоцитов, переводит обратимую агрегацию тромбоцитов в необратимую; необратимая агрегация сопровождается реакцией освобождения второго порядка, вследствие которой возникают гидролазы, АДФ в высокой концентрации и вазоактивные вещества (серотонин, адреналин, норадреналин) (20). Благодаря воздействию этих веществ формируется белый тромбоцитарный, или первичный, тромб. Из-за недостатка VП, V, Х факторов и протромбина будет нарушаться первичный гемостаз. После образования первичного тромба полностью блокируется кровотечение из сосудов микроциркуляции.

Таким образом, гемостаз в сосудах микроциркуляции осуществляется в основном клеточными (эндотелием, тромбоцитами) и сосудистым факторами (25). Свертывающая система крови не успевает включиться в полном объеме, а следы тромбина, обеспечивающего необратимую агрегацию, появляются вследствие быстрой активации тканевого тромбопластина (тканевый, или внешний, путь образования протромбиназы).

Поэтому первичный гемостаз будет нарушен при: изменениях сосудистой стенки (дистрофические, иммуноаллергические, неопластические и травматические капилляропатии); тромбоцитопении; тромбоцитопатии; сочетании этих факторов.

Сформировавшийся белый тромбоцитарный тромб, который подвергся вязкому метаморфозу и ретракции, надежно стягивает края поврежденного микрососуда, противостоит его дилатации и не пропускает жидкую часть крови.

В сосудах более крупного калибра, чем капилляры (венулах и артериолах), несмотря на их более длительный спазм (до двух часов), образовавшийся тромбоцитарный тромб не в силах противостоять расхождению краев поврежденного сосуда при его дилатации – белый тромб разрывается. Если этого не происходит, то даже неразрушенный пластиночный тромб в сосудах с повышенным кровяным давлением ненадежен, так как пропускает, словно сито, плазму и форменные элементы. И кровотечение хотя и медленно, но будет продолжаться. Поэтому для окончательного надежного гемостаза в поврежденных крупных венах и артериях первичного тромба недостаточно. У здоровых людей в таких случаях на первичном (белом) тромбоцитарном тромбе образуется красный (33).

Оперативное вмешательство выступает как мощный прокоагулянтный фактор и вызывает дальнейшее нарушение системы гемостаза. В патогенезе послеоперационных осложнений происходит ухудшение кровообращения в системе микроциркуляции и в магистральных сосудах (35).

Коагуляционный гемостаз

Процесс свертывания крови – многоступенчатая ферментная реакция, в которой принимает участие ряд белков, обозначаемых как факторы свертывания крови (табл. 1).

Одни из этих белков являются протеазами (факторы II, VII, IX, Х, ХI, XII, XIII), другие - акцелераторами (ускорителями) ферментных реакций (факторы V и VIII), третьи - конечным субстратом процесса (фактор I, или фибриноген). Взаимодействие факторов свертывания крови, их активация, а затем и инактивация почти на всем протяжении процесса происходят на плазменных фосфолипидных мембранах, от количества которых в плазме зависит либо ускорение, либо существенное замедление процесса свертывания.

Синтез ряда наиболее важных факторов свертывания (факторов V, VII, X, IX и II), а также двух основных физиологических антикоагулянов - протеинов С и S - осуществляется паренхиматозными клетками печени - гепатоцитами, причем для того, чтобы они могли участвовать в процессе свертывания крови, все эти факторы, кроме фактора V, должны подвергнуться γ-карбоксилированию витамин-К-зависимой карбоксилазой.

Таблица 1 Международная номенклатура факторов свертывания крови

Поэтому при дефиците витамина К и нарушении его всасывания из кишечника (при кишечном дисбактериозе, обтурации общего желчного протока), а также под влиянием непрямых антикоагулянтов (кумаринов, фенилина), являющихся функциональными антагонистами витамина К, нарушается синтез всех витамин К-зависимых факторов свертывания, а также протеинов С и S, вследствие чего может возникнуть тяжелая кровоточивость, сочетающаяся в некоторых случаях с микротромбированием сосудов и некрозами тканей из-за недостатка антикоагулянта – протеина С.

Такое же нарушение свертываемости крови наблюдается и при тяжелых заболеваниях печени, но при этом снижается уровень в крови не только всех витамин К-зависимых факторов свертывания, но и фактора V, а также альбумина (28).

Различают три этапа процесса свертывания крови.

Первый этап завершается активацией фактора X в так называемом протромбиназном комплексе, в состав которого входят, наряду с фактором X, фактор V, ионы кальция и фосфолипидные матрицы. Активация факторов в этом комплексе может осуществляться двумя путями: внешним и внутренним. Запуск внешнего реализуется поступлением из тканей в кровь тканевого тромбопластина (или тканевого фактора - ТФ). Свертывание по этому механизму, который в пробирке имитируется добавлением к плазме тканевого тромбопластина, обозначается как протромбиновый (тромбопластиновый) тест. Коагуляция в нем происходит очень быстро, в течение 12-15 с.

Другим механизмом запуска процесса свертывания крови является внутренний путь. Он связан с контактом крови с субэндотелием (коллагеном), а также с разрушенными эритроцитами (при внутрисосудистом гемолизе), а в пробирке – контактом со стеклом. При этом механизме последовательно активируются в комплексах «фактор XII (фактор Хагемана) + прекалликреин + фактор XI», а затем «фактор XI + фактор IX + фактор VIII», после чего процесс, как и в предыдущем механизме, замыкается на активации фактора X с образованием протромбиназного комплекса. Внутренний механизм первого этапа свертывания протекает намного медленнее, чем внешний (42). Он определяется общим временем свертывания крови, временем рекальцификации цитратной плазмы и активированным парциальным тромбопластиновым временем (АПТВ).

В отличие от пробирочных опытов в организме оба указанных выше механизма свертывания крови не строго изолированы друг от друга, а взаимодействуют между собой.

Второй этапсвертывания крови заключается в активации протромбиназным комплексом (т. е. фактором Ха в комплексе с фактором Va + Ca²⁺ + фосфолипидная матрица) протромбина, который, расщепляясь, превращается в активный тромбин (фактор IIa). Таким образом, второй этап процесса свертывания завершается образованием активного тромбина.

На третьем этапепроцесса этот активный тромбин отщепляет от α- и β -цепей фибриногена два пептида А и два пептида В, в результате чего в плазме крови повышается содержание этих пептидов и одновременно – мономеров фибрина (МФ) с четырьмя свободными связями. Вслед за этим начинается процесс полимеризации МФ – образование их димеров, затем тетрамеров и, в конечном счете – волокон и сгустков фибрина (50).

1.1.2 Противосвертывающие механизмы и система фибринолиза

В свертывающей системе крови действуют силы как аутокатализа, или самоускорения, так и самоторможения, в силу чего многие факторы свертывания крови и их фрагменты приобретают свойства антикоагулянтов. В частности, сам фибрин и продукты расщепления фибриногена плазмином обладают противосвертывающим действием. Однако наиболее важны для поддержания крови в жидком состоянии так называемые первичные, т. е. самостоятельно синтезируемые и постоянно находящиеся в крови, антикоагулянты (табл. 2). Помимо перечисленных в табл. 2 важнейших физиологических антикоагулянтов, в патологических условиях в крови могут появляться в высоком титре иммунные ингибиторы факторов свертывания крови - антитела к факторам VIII, IX и другим, а также к фосфолипидным матрицам, на которых взаимодействуют и активируются факторы свертывания крови (антифоcфолипидный синдром) (42).

Таблица 2 Основные первичные антикоагулянты

Фибринолитическая (плазминовая) система, как и система свертывания крови, активируется как по внешнему, так и по внутреннему механизму.

Наиболее мощным внешним активатором этой системы является продуцируемый в эндотелии, а также в ряде тканей тканевый плазминогеновый активатор (ТПА), на долю которого приходится около 70% всего активаторного эффекта. Еще около 15% внешнего механизма активации приходится на фермент урокиназу, который вырабатывается в почках и в наибольшей своей части выделяется с мочой, а в кровь попадает в значительно меньшем количестве. На остальные активаторы, поступающие в кровь извне, приходится лишь небольшая часть указанной активности, но в патологических условиях она может быть резко усилена тканевыми и лейкоцитарными протеазами и другими факторами.

Внутренний механизм активации фибринолиза осуществляется в основном комплексом «фактор XIIа+калликреин+высокомолекулярный кининоген» (так называемый XIIа - калликреин зависимый фибринолиз), активированными протеинами C+S.

Механизмы активации фибринолиза замыкаются на плазминогене, который трансформируется в активный фермент – плазмин (в прошлом он обозначался как фибринолизин) (25).

Плазминоген и его активаторы фиксируются в основном на сгустках фибрина в тромбах, в связи с чем лизис фибрина преобладает над лизисом растворенного в плазме фибриногена. Кроме того, действию плазмина на фибриноген препятствует содержащийся в плазме мощный ингибитор этого фермента – а₂-антиплазмин. Однако при чрезвычайно сильной активации плазминогена происходит истощение а₂-антиплазмина, и в плазме крови обнаруживается большое количество продуктов как фибринолиза, так и фибриногенолиза. Эти продукты не идентичны друг другу. В результате расщепления фибриногена в плазме нарастает количество конечного продукта этого процесса - фрагмента D, тогда как при расщеплении фибрина увеличивается концентрация фрагментов D-D (димера) и D-E-D. Нарастание содержания в крови D-димера является важным маркером массивного тромбоза кровеносных сосудов, тромбоэмболии, диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (20, 25, 45).

1.1.3 Нарушения системы гемостаза у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

У онкологических больных система гемостаза реализуется преимущественно по внешнему механизму процесса свертывания крови, т.е. путем воздействия тканевого тромбопластина и так называемых раковых прокоагулянтов на факторы VII и Х. Многие виды опухолевых клеток продуцируют и выделяют в кровь большое количество ТФ, а также особых “раковых прокоагулянтов”, обладающих способностью активировать как фактор VII, так и фактор Х (8).

После операции значительно повышена интенсивность агрегации тромбоцитов. Эти изменения можно объяснить появлением тромбина и АДФ в результате прокоагулянтной активности опухолевых клеток и взаимодействием сиалопротеина мембран опухолевых клеток с тромбоцитами (8, 19, 26, 35).

В первую фазу свертывания крови и активации коагуляционного каскада возрастает скорость образования тромбопластина и тромбина, быстрее достигается максимальная активность этих факторов свертывания; во вторую фазу повышается активность факторов протромбиназного комплекса (II, VII, IX, X). Эти изменения индуцированы поступлением в кровоток высокоактивных прокоагулянтных субстанций из опухолевой ткани, наиболее важной из которых является серинопротеаза, которая независимо от тканевого фактора и фактора VIIа ведет к образованию фактора Ха. Отмечается увеличение концентрации фибриногена, что может быть связано с повышенным расходом фибрина на построение стромы опухоли и потреблением его в процессе внутрисосудистого свертывания крови (35).

Увеличивается количество РФМК, свидетельствуя о наличие в плазме комплексов фибрин-мономеров с продуктами деградации фибриногена. Таким образом оперативное вмешательство у онкологических больных вызывает развитие подострого ДВС-синдрома. При этом повышается агрегация тромбоцитов, потребление фибриногена и антитромбина III, увеличивается концентрация РФМК (43).

Гемокоагулирующие свойства легких

Легочная паренхима человека и животных богата тромбопластином. Т. Аструп и Пермин первыми обнаружили в легких большое количество активаторов фибринолиза. Легочная ткань содержит плазмин, плазминоген, активаторы и проактиваторы плазминогена, а также антиплазмин (44).

Гемокоагулирующие и фибринолитические агенты легких не только участвуют в локальном гемостазе, но и выделяются в кровь. В кровь поступают тромбопластин, естественные антикоагулянты, активаторы и ингибиторы фибринолиза.

Освобождение гемокоагулирующих и фибринолитических веществ из легких позволяет считать их одним из органов – эффекторов (наряду с сосудами, почками, желудочно-кишечных трактов), регулирующих свертывание крови и ее фибринолитическую активность. В стрессовых ситуациях и операциях на легких эти соединения выделяются в кровоток в более значительном количестве, нежели в норме, приводя к нарушениям гемокоагуляции. Гиперкоагулемия и внутрисосудистое свертывание крови при операциях на легких связаны с их тромбопластической активностью (44).

Гемокоагулирующие свойства предстательной железы, почек и мочевыводящих путей

Тромбогеморрагические осложнения при урологических операциях возникают возникают особенно часто. Причину этих осложнений связывают с поступлением в кровоток из оперируемого органа гемокоагулирующих и фибринолитических агентов (44).

Предстательная железа и ее аденома содержит активные тромбопластин, естественные антикоагулянты, антигепариновый фактор, фибриназу, ферменты, подобные плазменным факторам V и VII, активаторы и ингибиторы фибринолиза, вещества активно участвующие в сосудисто-тромбоцитарном гемостазе. При попадании в кровоток тканевой жидкости предстательной железы или ее аденомы доминирует действие тромбопластических и антифибринолитических соединений, а это способно привести к интравазальной гемокоагуляции и торможению фибринолиза.

При урологических операциях на свертывание крови могут влиять и гемокоагулирующие вещества мочевыводящих путей, которые травмируются при операционном вмешательстве. Экстракты мочевыводящих путей содержат антикоагулянты, тканевую фибриназу, усиливающую стабилизацию фибрина. Таким образом, мочевыводящие пути содержат весьма активный тромбопластин, фибриназу, естественные антикоагулянты, активаторы и ингибиторы фибринолиза.

Почки относятся к органам с высокой тромбопластической и фибринолитической активностью. В почках синтезируются и освобождаются в кровь и мочу тромбопластин, антигепариновые субстанции, антикоагулянты, вещества подобные плазменным факторам V и ХIII. При попадании мочи на раневую поверхность при аденомэктомии или при операциях на мочевом пузыре она будет стимулировать локальное свертывание и тормозить локальный фибринолиз, создавая надежный гемостаз в операционном поле (44).

Гемокоагулирующие свойства желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы

Местные и генерализованные тромбогеморрагические нарушения при заболеваниях пищеварительной системы встречаются весьма часто (44).

При онкологических заболеваниях гемокоагулирующие свойства стенок ЖКТ меняются. Опухоли обладают большей тромбопластической и антигепариновой активностью, чем не пораженные стенки. Экстракты опухоли желудка укорачивают тромбиновое время плазмы. Вытяжки же здорового желудка обладают высокой антикоагулянтной активностью. Опухоли желудка содержат меньше фибриназы, чем интактные участки. Фибринолитическая активность опухоли снижена вследствие увеличения в них ингибиторов фибринолиза. Фибринолитические компоненты опухолей содержат проактиватор и активатор плазминогена, плазминоген, большое количество ингибиторов. Обнаружено уменьшение содержания антигепариновых и фибрин-стабилизирующих соединений, почти полное отсутствие гепарина, комплексные соединения гепарина (с фибриногеном, адреналином, плазмином, серотонином). Усиление антигепариновой активности в опухоли ведет к связыванию гепарина, что благоприятствует действию активного тромбопластина опухолевой ткани и приводит к образованию в ней фибрина, защищающего клетки опухоли от канцеролитических агентов крови. В крови, оттекающей от пораженного раком желудка, усилена тромбопластическая и угнетена фибринолитическая активность, что объясняется выделением из опухоли ингибиторов фибринолиза и угнетением активаторов плазминогена (44).

Ткани поджелудочной железы обладают тромбопластической активностью, проявляют антифибринолитическое действие. При операциях на поджелудочной железе трипсин и гемокоагулирующие субстанции проникают в кровоток. Трипсин обладает многосторонним действием на свертывание крови: он усиливает агрегацию тромбоцитов, активирует плазменные факторы ХII, ХI, Х, VII, II, ХIII, запуская свертывание крови как по внешнему, так и по внутреннему пути. Он лизирует фибриноген и фибрин с образованием продуктов их деградации. Таким образом, трипсин усиливает течение тромбогеморрагического синдрома (44).

1.2 Пептидергическая система

1.2.1 Механизм образования активных форм пептидов

В регуляции гемостаза принимают участие пептиды. Это природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O)–NH. Могут содержать в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода). Большинство биологически активных пептидов синтезируется в составе высокомолекулярных неактивных предшественников – препробелков, которые подвергаются посттрансляционной модификации различного типа (18). Секретируемые белково-пептидные продукты синтезируются на мембраносвязанных рибосомах ЭПР. Благодаря наличию на N-конце препроформы нейропептида набора гидрофобных аминокислот,