Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Нейропептиды и их обмен
1.2. Физико-химические свойства, субстратная специфичность и биологическая роль карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
1.2.1. Карбоксипептидаза Н
1.2.2. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
1.3. Половые стероидные гормоны
1.3.1. Тестостерон
1.3.2. Прогестерон
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод введения половых стероидных гормонов
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н
2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
2.2.3. Метод определения концентрации белка
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Тканевое распределение активности основных карбоксипептидаз у самцов и самок мышей
3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
3.1.2. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
3.2. Активность основных карбоксипептидаз у самок мышей при введении тестостерона и прогестерона
3.2.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самок мышей
3.2.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самок мышей
3.3. Активность основных карбоксипептидаз у самцов мышей при введении тестостерона и прогестерона
3.3.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самцов мышей
3.3.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самцов мышей
3.4. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы in vitro при действии тестостерона и прогестерона
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
АКТГ – адренокортикотропный гормон
АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота
ГАМК – гамма-аминомасляная кислота
ГОМК – гамма-оксимасляная кислота
ГГГС – гипоталамо-гипофизарно-гонадная система
ГГНГС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадная система
ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГнРФ – гонадотропин-рилизинг-фактор
ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота
ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДГТ – дигидротестостерон
КП – карбоксипептидаза
КП M – карбоксипептидаза M
КП N – карбоксипептидаза N
КП U – карбоксипептидаза U
КП В – карбоксипептидаза В
КП Н – карбоксипептидаза Н
ЛГ – лютеинизирующий гормон
ПСА – простатический специфический антиген
ТРФ – тиреотропин-рилизинг-фактор
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ФМСФ-ингибируемая КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ЭДТА – этилдиаминтетраацетат натрия
Половое развитие и дифференциация, а также процессы, связанные с размножением, представляют собой наиболее интересные проблемы современной биологии. Важную роль в этих процессах играют половые стероидные гормоны (23, 24, 27, 37, 39, 42, 43). Синтез и секреция половых стероидов регулируется пептидными гормонами гипоталамуса (гонадотропин-рилизинг-фактор) и гипофиза (лютеинизирующий гормон и фолликулостимулирующий гормон) (24, 27, 37, 39, 42). Кроме того, в регуляцию уровня половых стероидных гормонов вовлекаются многие нейропептиды, которые обычно не связывают с половой системой. Например, b-эндорфин (277), энкефалины (61), АКТГ (277), Arg8-вазопрессин (175, 214, 266), Arg8-вазотоцин (214) и др. Нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных неактивных предшественников, в структуре которых аминокислотные последовательности активных пептидов ограничены парами остатков основных аминокислот (1, 65, 113, 120, 147). Для высвобождения активных пептидов необходимо последовательное действие трипсиноподобного и карбоксипептидазо-В-подобного ферментов (113, 120, 152, 170). К карбоксипептидазо-В-подобным относятся ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот с карбоксильного конца белка-предшественника. Именно эти ферменты участвуют на конечных стадиях процессинга и, вероятно, играют определенную роль в регуляции уровня активных пептидов (43, 120, 152, 170). Известно, что карбоксипептидаза Н (КП Н, КФ 3.4.17.10) участвует в биосинтезе многих нейропептидов, таких как инсулин (6, 133, 253), глюкагон (46), энкефалины (46, 49), АКТГ (54), вазопрессин (57), окситоцин (58), вещество P (59), атриальный натрийуретический фактор (38). Поскольку многие из этих пептидов принимают участие в регуляции уровня половых стероидных гормонов (24, 27, 39, 42), то возможно, что КП Н вовлекается в процессы половой дифференцировки и размножения, однако ее роль в этих процессах до конца не ясна. Вместе с тем предполагают, что функции недавно обнаруженной ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ-ингибируемой КП) сходны с таковыми КП Н. Однако роль этого фермента, практически, не изучена.
Целью данной работы было изучение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей при введении тестостерона и прогестерона. При выполнении работы были поставлены следующие задачи. 1. Сравнить распределение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в отделах ГГНГС самцов и самок. 2. Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз в динамике у самок при введении разных доз тестостерона и прогестерона. 3. Сравнить активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок при введении тестостерона и прогестерона. 4. Изучить активность исследуемых ферментов in vitro при действии тестостерона и прогестерона.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние тестостерона и прогестерона на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самцов и самок мышей. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от пола животного и времени после введения стероидных гормонов. Полученные результаты представляют интерес для более глубокого понимания механизмов функционирования пептидергических систем и роли основных карбоксипептидаз в процессах, связанных с половыми стероидными гормонами.
Апробация и публикации. Материалы диссертации доложены на IV Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 1999 г.), на XXXVIII Международной студенческой конференции ”Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, 2000 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (1998, 1999, 2000). По результатам исследования опубликовано 5 статей.
1.1. Нейропептиды и их обмен
Нейропептиды – это полифункциональные высокоактивные вещества пептидной природы, которые играют важную роль в реализации и регуляции различных физиологических и поведенческих реакций организма.
Нейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, проявляют анальгетические эффекты, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения (26, 28, 30, 35, 140, 169, 207). Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания (2, 4, 38, 40). Нейропептиды влияют на половую дифференциацию организма (ГнРФ, ЛГ, ФСГ, пролактин (24, 27, 39, 42, 43)), на процессы внимания и памяти (например, АКТГ и α-меланотропин - стимуляторы запоминания и внимания), на эмоциональное поведение (тиролиберин, меланостатин, кортиколиберин - стимуляторы эмоционального поведения), обладают анальгезирующим действием (нейротензин, опиодные пептиды) (34, 36).
Уровень нейропептидов определяется соотношением скоростей их синтеза и деградации.
Нейропептиды синтезируются в организме, как правило, в виде высокомолекулярных неактивных предшественников (препропептидов) (22). В состав последних могут входить аминокислотная последовательность как одного, так и нескольких нейропептидов. Известно много белков, содержащих в своей структуре последовательности нейропептидов: предшественник гонадотропин-рилизинг-фактора, проопиомеланокортин, препроэнкефалин А, продинорфин (препроэнкефалин В) и другие (1, 32). В частности, в состав предшественника гонадотропин-рилизинг-фактора входит ГнРФ и гонадолиберин-ассоциированный пептид.
Все препропептиды содержат на N-конце сигнальную последовательность из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Нейропептиды, входящие в состав предшественника, как правило, ограничены с C- и N-концов (фланкированы) парами остатков основных аминокислот – аргинина и лизина (1, 3, 65, 81, 113, 120, 147).
Сигнальная последовательность, взаимодействуя с рецепторами эндоплазматического ретикулума, способствует переносу предшественника нейропептида в просвет ретикулума. В цистернах эндоплазматического ретикулума под действием сигнальной пептидазы происходит отщепление сигнальной последовательности, а также N-гликозилирование и формирование характерной для полипептида третичной структуры, которая препятствует обратному выходу белка в цитоплазму. Посттрансляционная модификация, включающая гликозилирование, амидирование, ацетилирование или сульфирование, предотвращает нарушение процессинга и образование нетипичных пептидов (1, 19).
Предшественники нейропептидов синтезируются на рибосомах гранулярного эндоплазматического ретикулума. Как сказано выше, препропептиды не обладают функциональной активностью. Для получения активных форм, они подвергаются посттрансляционному процессингу, одним из основных механизмов которого является ограниченный протеолиз (3, 5, 20, 21).
Процессинг биологически активных пептидов осуществляется при передвижении молекул пропептидов по гранулярному эндоплазматическому ретикулуму, комплексу Гольджи и в секреторных везикулах (123). Секреторные везикулы содержат полный набор ферментов, необходимых для процессинга и специальные системы поддержания pH внутри везикул (22).
Процессинг нейропептидов внутри секреторных везикул включает в себя эндо- и экзопротеолитические реакции. Эндопротеолиз осуществляется при действии трипсиноподобных протеиназ (проопиомеланокортин-превращающего фермента (176, 177), продинорфин-превращающего фермента (95, 130), тиоловой прогормонконвертазы (57, 58), субтилизиновых эндопептидаз фурина, PC1, PC2, PC3 и PC4 (238)). В результате происходит расщепление пропептидов по парам остатков основных аминокислот (22, 258). Продукт, образовавшийся после действия эндопептидаз, далее подвергается экзопротеолизу с участием аминопептидазо-В- и/или карбоксипептидазо-В-подобных ферментов. В результате происходит удаление ”лишних” N- и/или С-концевых остатков основных аминокислот.
Известно, что в различных тканях из одного белкового предшественника образуются различные нейропептиды (1, 32). Так из проопиомеланокортина в аденогипофизе образуются преимущественно АКТГ, β-липотропин и β-эндорфин. В промежуточной доле гипофиза они подвергаются дальнейшему расщеплению с образованием α-меланоцитстимулирующего гормона и фрагментов β-эндорфина (1). Тканевая специфичность, по-видимому, может быть связана с различным набором ферментов в разных тканях и/или с различными способами регуляции их активности. Поэтому представляет интерес изучение ферментов процессинга со сходной (но не идентичной) субстратной специфичностью. Такие исследования интересны не только для выяснения вопросов, связанных с функционированием данных энзимов, но и для понимания механизмов образования различных нейропептидов из одних и тех же предшественников в разных тканях. Поскольку карбоксипептидазо-В-подобные ферменты, то есть отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с карбоксильного конца пептидов, участвуют в конечной стадии процессинга биологически активных пептидов, то их изучение представляет особый интерес.
1.2. Физико-химические свойства, субстратная специфичность и биологическая роль карбоксипептидазо-В-подобных ферментов
К настоящему времени в тканях человека и животных обнаружен ряд таких ферментов: КП B (КФ 3.4.17.2), КП N (КФ 3.4.17.3), КП M (КФ 3.4.17.12), КП U, КП H (КФ 3.4.17.10), ФМСФ-ингибируемая КП и др.
КП B, КП N, КП M, КП U и КП Н отщепляют аргинин и лизин с С-конца пептидов (50, 76, 91, 102, 104, 120, 122, 141, 142, 143, 227, 247). КП B способнa также (но с меньшим сродством) отщеплять остатки ароматических аминокислот (50). Все вышеперечисленные карбоксипептидазы, кроме КП U и КП Н, обладают и эстеразной активностью (50, 76, 91, 102, 104, 120, 122, 141, 142, 143, 144, 227, 247). Причем у КП N и КП M она намного превышает пептидазную (91, 102, 104, 143, 227, 247).
КП Н имеет кислый оптимум рН 5,5-6,0 (185, 234). Другие карбоксипептидазы проявляют максимальную активность в нейтральной либо слабощелочной среде. В частности, оптимум рН для КП B, КП N и КП M равны, соответственно, 7,0-9,0; 7,6 и 7,0 (50, 91, 102, 212, 227).
Ионы Со2+ повышают пептидазную активность КП B, КП N, КП M, КП Н (91, 143, 227, 247, 284), но снижают эстеразную активность КП B (284), а также пептидазную активность КП U (76, 142). Ионы Cd2+ снижают активность КП B (284), КП N (143, 227), КП M (247). Хелатирующие агенты (ЭДТА, о-фенантролин), и дикарбоновые кислоты, такие как ГПЯК, АПМЯК и ГЭМЯК, ингибируют КП В, КП N, КП M, КП Н (50, 76, 89, 91, 102, 142, 143, 144, 147, 196, 195, 212, 227, 247, 276).
Карбоксипептидазы КП B, КП N, КП M, КП U и КП H являются металлокарбоксипептидазами и содержат в своих активных центрах ионы Zn2+ (89, 108, 121, 143, 181, 262, 263).
КП В (Mr 34 кДа) (74), КП M (Mr 62 кДа) (91, 247) и КП Н (89, 181, 262) состоят из единственной полипептидной цепи. Остальные карбоксипептидазы состоят из нескольких субъединиц: КП N (Mr 280 кДа) – из четырех (двух с Mr 88 кДа, не обладающих ферментативной активностью, одной с Mr 55 кДа и одной с Mr 48 кДа) (173); КП U – из восьми (144, 276).
Аминокислотные последовательности металлокарбоксипептидаз схожи между собой. В частности, аминокислотная последовательность активных субъединиц КП N на 43% идентична последовательности КП H, на 41% - КП M, на 29% - КП A и на 18% - КП B, аминокислотная последовательность КП M на 41% идентична КП H, на 15% - КП B и КП A (91, 246, 249).
КП B, КП N, КП M, КП U, КП H синтезируются в виде неактивных проформ, которые приобретают активность под действием трипсина или трипсиноподобных ферментов (89, 91, 92, 122, 141, 142, 181, 249).
Основные карбоксипептидазы отличаются распределением в тканях и органах.
КП B обнаружена в экзокринных клетках поджелудочной железы и в поджелудочном соке (50).
КП N присутствует в плазме крови, имеется единичная работа по обнаружению КП N в микросомах плаценты (161).
КП M широко распространена во всех органах и тканях. Наибольшая активность фермента обнаружена в человеческой плаценте, в 3-4 раза ниже - в почках, еще в 2-2,5 раза ниже - в легких (248). В нервной ткани активность фермента на порядок ниже, чем в плаценте. Активность КП M в периферических нервах выше, чем в головном мозге (209).
Биологическая роль карбоксипептидаз разнообразна.
КП B участвует в переваривании белков пищи (212).
КП N, КП M, КП U, в отличие от КП B, способны вовлекаться в обмен различных пептидов. В частности, есть данные о том, что КП N (наряду с КП M и КП U) может вовлекаться в расщепление брадикинина (77, 91, 160, 239, 241, 247), инактивацию анафилотоксинов (69, 76, 141, 142, 229), а также (наряду с КП M) – в превращения предшественников энкефалинов (91, 247, 248). Кроме этого, КП N способна участвовать в постсинаптической модификации креатинкиназы (270), енолазы (279). Показано, что активность КП N изменяется при гипербрадикинизме и различных легочных заболеваниях (например, астме) (103).
Предполагают, что КП U вовлекается в процессы свертывания крови и локального воспаления при ревматоидном артрите (77).
Карбоксипептидаза Н (КП Н, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из мозга, гипофиза и хромаффинных гранул надпочечников (120). Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми основными аминокислотами (14, 16, 98, 275). КП Н хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg, а также превращает 125I-Met-энкефалин-Arg и 125I-Met-энкефалин-Lys в 125I-Met-энкефалин (147, 152). Фермент отщепляет остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ1-14) и остатки -Arg с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкефалин-Arg (275). КП Н с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина (215, 251).
Карбоксипептидаза Н является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+ (151, 152). Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0 (98, 132, 152, 242, 281), pI 4,9 (185), ингибируется CuCl2, HgCl2, р-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином (98, 122, 147, 152). Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Ki 8,8 и 7,5, соответственно (89, 118, 234, 260). КП Н ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором (150, 225, 235). С окситоцином и АКТГ ингибирование проявляется уже при концентрации 2-20 мМ (150). Ki для Met-энкефалина, Leu-энкефалина, Met-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8 и Met-энкефалин-Arg6-Phe7 равны, соответственно, 12,0, 6,5, 7,0 и 5,5 мМ (150). Лизин и аргинин являются конкурентными ингибиторами КП Н. Ki для аргинина и лизина равны, соответственно, 4,6±1,3 и 7,6±1,9 (146). Бромацетил-D-Arg, необратимый ингибитор КП В и КП N, также ингибирует и КП Н (118). Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КП Н (98). Фермент активируется ионами Co2+ в 5-10 раз, ионами Ni2+ в 2-3 раза, (89, 98, 122, 152, 234, 259, 260). КП Н способна связывать ионы Ca2+ (211). При повышенной температуре она дестабилизируется ионами Ca2+ и стабилизируется низкой концентрацией этиленгуанидинтетрауксусной кислотой (211). Ионы Ca2+ не влияют на активность фермента (211). Этиленгуанидинтетрауксусная кислота в микромолярных концентрациях активирует КП Н. В этом случае происходит изменение Vmax, а не Km (211). Уменьшение pH и увеличение концентрации ионов Ca2+ индуцируют агрегацию данного фермента (255). Освобождение КП Н и инсулина из изолированных клеток Лангерганса крысы ингибируется удалением ионов Ca2+ из среды (135, 136).
Таким образом, присутствие ионов Ca2+ в среде может способствовать тепловой дестабилизации КП Н, а также агрегации ее в проводящих путях комплекса Гольджи и освобождению из клетки.
Ген КП Н был клонирован и секвенирован (48, 187, 232). Транскрипция КП Н осуществляется с единственного сайта транскрипции (250). мРНК КП Н состоит из 2100 нуклеотидов (114).
КП Н синтезируется в виде предшественника с Mr 75 кДа, состоящем из 476 аминокислотных остатков (154, 232, 254) (у морского черта Lophius americanus – из 454 (184)). Он, предположительно, содержит сигнальный пептид. Затем проКП Н с Mr 65-75 кДа подвергается посттрансляционному С- и N-концевому (133, 149, 232). Этот процесс идет в секреторных везикулах под действием прогормон-конвертазоподобного фермента (116, 253).
Во всех органах и тканях КП Н представлена в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами, имеют сходные свойства (идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам) и отличаются активностью (растворимая более активна). Mr мембранной формы 55-57 кДа, Mr растворимой формы 53-57 кДа (15, 17, 89, 98, 132, 134, 147, 153, 154, 259, 262, 281).
Следует отметить, что с повышением рН мембраносвязанная форма становится неустойчивой и переходит в растворимую. По-видимому, это связано с комбинированными полярными и гидрофобными взаимодействиями карбоксильного конца пептида (115, 134). Имеются сведения о том, что мембранная форма кп н (57 кДа) связана с эндоплазматическим ретикулумом и элементами комплекса Гольджи, а растворимая форма кп н (54 кДа) – с секреторными гранулами (133). Соотношение мембраносвязанной и растворимой форм КП Н в разных клетках и тканях отличается. В частности, в клетках линий RIN 1046-38 и RIN 1046-44 75% зрелой КП Н обнаружено в мембраносвязанной форме (107). С другой стороны, в передней и задней долях гипофиза 70% всей активности КП Н представлено растворимой формой (222).
В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся по молекулярной массе. В растворимой фракции очищенных секреторных гранул, содержащих инсулин, выявлена форма КП Н с Mr 55 кДа (89). В передней доли гипофиза обнаружено две формы КП Н – с Mr 56 и 53 кДа, а в задней – только форма с Mr 53 кДа. Эти формы имеют сходные каталитические свойства (222, 223). Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КП Н, по-видимому, связано с наличием у первой, так называемого ”мембранного якоря”. С-концевая область мембраносвязанной КП Н (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную a-спираль, которая и может служить гидрофобным ”мембранным якорем” (105, 206, 271). С другой стороны, D. Parkinson (222, 223) высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.
Уровни мРНК КП Н и активности КП Н в мозге и тканях в целом коррелируют между собой (66, 114). мРНК КП Н и ферментативная активность обнаружена в клонах эндокринных клетках – AtT-20, GH-3, GH4C1 и неэндокринных – L, 3T3, SK-HEP-1, HEK293, COS, C127 (100, 163). Наивысшие уровни мРНК КП Н обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КП Н у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга (183).
Высокая экспрессия мРНК КП Н отмечена в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса – местах преимущественного синтеза окситоцина и вазопрессина (72). Обнаружено увеличение концентрации мРНК КП Н при увеличении содержания этих двух пептидов (72). В то же время, в других зонах мозга с высоким уровнем нейропептидов не наблюдается изменений уровня мРНК КП Н при осмотической стимуляции (72).
Отделы мозга отличаются по уровню активности КП Н более чем в 10 раз. Распределение активности этой карбоксипептидазы в целом соответствует распределению нейропептидов (18, 25, 122, 182). Максимальная активность растворимой формы фермента обнаружена в гипофизе: в передней доли – в 20 раз больше, чем в задней (122, 180, 222, 256, 262). Далее по мере снижения активности следуют стриатум, гиппокамп, кора больших полушарий, таламус с гипоталамусом, средний мозг и мозжечок (256). При этом в гипоталамусе высокая активность КП Н обнаружена в медиальном возвышении, супраоптическом, паравентрикулярном и супрахиазматическом ядрах (180). Супраоптическое ядро (богатое телами нейронов) содержит, в основном, неактивную 65 кДа форму КП Н. Срединное возвышение и гипофизарная ножка – богатые аксонами области – содержат формы КП Н как с Mr 65 кДа, так и с Mr 55 кДа. Нервные окончания задней доли гипофиза содержат, в основном, форму КП Н с Mr 55 кДа (149). В стриатуме высокое содержание имуннореактивной КП Н отмечено в стриасомах (клетках богатых веществом Р) (81, 225). В гиппокампе КП Н обнаружена в пирамидальных клетках и во внутренней части молекулярного слоя зубчатой извилины. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины (180). Кроме этого, активность КП Н обнаружена в сердце – правом и левом предсердиях (активность в тканях желудочков очень низкая) (181, 182). Имеются сведения о наличии активности КП Н в водянистой жидкости глаза человека (220). Тканевое и региональное распределение КП Н сходно у разных видов животных (например, у быка, крысы, мыши, акулы, Xenopus и Aplysia) и человека (117, 165).
В клетке КП Н локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами – инсулином (133), глюкагоном (6, 253), энкефалинами (46, 49), АКТГ (54), вазопрессином (57), окситоцином (58), веществом P (59), атриальным натрийуретическим фактором (38).
Следует отметить, что уровень мРНК КП Н способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия. В частности, уровень мРНК КП Н повышается в ганглионарных клетках сетчатки глаза сразу после смены условий освещенности, особенно при смене темноты на свет. Однако в это же время снижается количество самого белка КП Н. В темноте КП Н экспрессируется в фоторецепторных клетках. На свету экспрессия КП Н резко индуцируется в ганглионарных клетках сетчатки глаза, а в фоторецепторных клетках экспрессия снижается (237).
Уровень мРНК КП Н увеличивается под действием галоперидола в промежуточной и задней долях гипофиза; в клетках PC12 (клеточная линия феохромоцитомы крыс) – под влиянием фактора роста нервов (87, 131, 172, 221, 268). Короткое (1-3 ч) воздействие 50 мМ раствора KCl стимулирует секрецию КП Н клетками РС12 без синтеза белка фермента. Пролонгированное (24-48 ч) действие раствора KCl стимулирует секрецию КП Н без изменения внутриклеточного уровня КП Н. При этом уровень мРНК КП Н не изменяется после 2-х часов воздействия, увеличивается на 35% после 5 часов и на 75% после 24-72 часов воздействия (87).
В клетках GH4C1 (из переднего гипофиза крысы, продуцирующие пролактин) 50 мМ раствор KCl увеличивает секрецию КП Н и пролактина в 10 раз, а 100 мМ тиреотропин-рилизинг фактор – в 2-3 раза (119). Кроме того, эстрадиол (1 нМ), инсулин (300 нМ) и фактор роста эпидермиса (10 нМ) увеличивают внутриклеточный уровень КП Н в 2 раза по сравнению с контролем. Km при этом не изменяется, но увеличивается Vmax (119).
Бромкриптин вызывает снижение уровня мРНК КП Н в промежуточной доли гипофиза (221).
C. Rodriguez и соавт. обнаружили, что действие дексаметазона на клетки AtT-20 снижает уровень мРНК КП Н и мРНК проопиомеланокортина примерно на 30% (232). С другой стороны, прибавление кортикотропин-рилизинг фактора к клеткам, которые подвергались воздействию дексаметазона, вызывает 2-3-х кратное увеличение уровня мРНК КП Н и мРНК проопиомеланокортина (232). Авторы считают, что уровни мРНК проопиомеланокортина и мРНК КП Н согласованно регулируются кортикотропин-рилизинг фактором и стероидными гормонами. При действии кортикотропин-рилизинг фактора на клетки AtT-20, не подверженные действию дексаметазона, происходит возрастание активности КП Н (186).
При хроническом прибавлении дексаметазона, кортикостерона, кортикотропин-рилизинг фактора, соматостатина к клеткам линии AtT-20/D16v уровень мРНК КП Н и активность КП Н не изменяются (186, 265).
При внутрибрюшинном введении дексаметазон и гидрокортизон (в дозах 1 и 100 мг на кг массы тела, соответственно) снижают активность растворимой и мембраносвязанной формы КП Н в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс, но динамика влияния во времени отличается (10). В изученные интервалы (0,5, 4 и 24 часа после инъекции) дексаметазон сильнее подавляет активность в начальный период, тогда как действие гидрокортизона более выраженно через 24 часа после введения. In vitro дексаметазон и гидрокортизон не оказывают влияния на активность КП Н (10). Авторы предполагают, что снижение активности КП Н in vivo происходит за счет снижения синтеза мРНК КП Н.
Smith D.R. и соавт. (250) предполагают, что экспрессия гена КП Н регулируется тиреоидными гормонами. В частности, они установили, что экспрессия гена КП Н в переднем гипофизе крыс стимулируется при системном недостатке тиреоидных гормонов.
С возрастом у самцов крыс активность КП Н изменяется следующим образом. У эмбрионов мРНК КП Н экспрессируется как в нервной (таламус, гипоталамус, средний и продолговатый мозг, кортикальная пластинка и спинной мозг, а также периферические ганглии), так и в других тканях (сердце и первичные хрящи) (283). В постнатальном периоде практически во всех отделах мозга, в частности в гипофизе и гипоталамусе, а также в надпочечниках, активность данного фермента повышалась со дня новорожденности до 30-го дня постнатального периода. У 90-дневных самцов отмечено некоторое снижение активности КП Н. Наибольшая активность исследуемого фермента обнаружена у 120-дневных крыс. В семенниках активность КП Н снижалась в период со дня новорожденности до 10-го дня, затем повышалась до максимального уровня к 30-му дню постнатального периода. Далее вплоть до 120-дневного возраста, активность этого фермента практически не изменялась (12, 85).
Таким образом, в большинстве органов (за исключением семенников) обнаружено повышение активность КП Н с минимального уровня у новорожденных до максимального у 120-дневных крыс.
Следует отметить, что в постнатальном развитии (вплоть до половозрелого состояния) увеличивается содержание ряда нейропептидов (62), при этом зрелые формы нейропептидов преобладают над их предшественниками (197). Все это позоляет сделать предположение о наличии связи между изменениями активности КП Н и уровня нейропептидов в онтогенезе.
Имеются также данные о половых отличиях в активности КП Н (44). Наибольшие различия (в частности, в гипоталамусе) отмечены непосредственно в период полового созревания. Начиная с 90-дневного возраста, достоверные половые различия в активности данного фермента обнаружены лишь в почках и половых железах. Особенно это выражено у 120-дневных крыс.
Таким образом, в период полового созревания различия в уровне активности КП Н между самцами и самками отмечены практически во всех органах (гипофиз, гипоталамус и половые железы), отвечающих за половую дифференцировку организма. В то же время, у половозрелых животных (120-дневных) различия сохраняются лишь в гонадах.
Имеются сведения о том, что инъекции увеличивающихся доз ГЭМЯК в желудочки мозга приводят к дозозависимому снижению уровня Met- и Leu-энкефалинов в гипоталамусе крыс. При этом отсутствовали измененения в содержании β-эндорфина и динорфина1-17. Введение ГЭМЯК увеличивало содержание лютеинизирующиего гормона (ЛГ) и гонадотропин-рилизинг-фактора (ГнРФ) на 75% и снижало уровень пролактина в плазме крови на 60% (71).
Обнаружено, что синдром ожирения связан с мутацией в гене, кодирующем КП Н (единичная точечная мутация Ser202 на Pro). Она уменьшает эффективность процессинга прогастрина, при этом наблюдается повышение синтеза прогастрина и сохранение почти нормальной продукции биологически активных гастринов (170, 269). Кроме того, эта мутация у мышей линии fat/fat приводит к нарушениям процессинга проинсулина (и нарушению внутриклеточного фолдинга КП Н) (83, 158, 159, 210, 272, 273). У мышей мембраносвязанная КП Н выступает в роли сортирующего рецептора – специфически связывает белки, проходящие через регулируемый секреторный путь. В частности, КП Н секреторных гранул гипофиза быка, связывает проинсулин, проэнкефалин и N-проопиомеланокортин1-26 со сходной кинетикой (83). Это связывание происходит с низким сродством и является ионозависимым (83). При дефиците КП Н гормоны гипофиза секретируются через нерегулируемый секреторный путь. В частности, происходит неправильный внутриклеточный транспорт проопиомеланокортина и гормона роста через конститутативный путь (240), а также нарушение созревания про-нейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона (236). Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие (84, 178).
Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на культуры клеток, нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КП Н свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как вазопрессин, окситоцин, нейротензин и меланоцитстимулирующий горомон, вещество Р, энкефалины и др. (122, 147, 148, 152, 182, 215, 225, 235, 236, 275). Кроме того, изменение уровня мРНК КП Н и активности фермента под действием глюкокортикоидов (10, 186, 232, 265), половые отличия в уровне активности фермента (44), обусловливают интерес к изучению КП Н при введении половых стероидных гормонов.
1.2.2. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году (7). Более подробные сведения появились в 1995 году (11, 13).
Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-ингибируемая КП) отщепляет остатки основных аминокислот с карбоксильного конца пептидов. По данным тонкослойной хроматографии фермент расщепляет дансил-Phe-Leu-Arg с образованием только дансил-Phe-Leu и аргинина, дальнейшего расщепления дансил-Phe-Leu не происходит (11). Он имеет молекулярную массу 100-110 кДа и проявляет максимальную активность при pH 6,0-6,5 (11). 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) и р-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют фермент. Под дейстивием иодоацетамида карбоксипептидазная активность снижается только на 40%. Другие реагенты на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующие агенты (ЭДТА) и специфический ингибитор КП Н (ГЭМЯК), а также ионы Co2+ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-ингибируемая КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl (9). Km для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg имеет значения 48 и 96 мМ, соответственно.
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КП А, катепсин А, КФ 3.4.16.1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга (73, 93, 139, 188, 189, 194, 230).
Тканевое и региональное распределении ФМСФ-ингибируемой КП изучено у нескольких видов млекопитающих (8, 13, 44, 45). У ежа европейского (Erinaceus europaeus) наиболее высокая активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы обнаружена в гипофизе, несколько ниже (в порядке убывания) – в семенниках, легких, почках, надпочечниках и селезенке. При этом активность в гипофизе примерно в 2 раза выше, чем в селезенке (13). У кошки максимальная активность отмечена также в гипофизе, затем в порядке снижения активности следуют семенники, надпочечники, печень и почки (8). У крысы максимальная активность данного фермента обнаружена в надпочечниках. В гипофизе активность была в 1,6 раза меньше, а в семенниках – в 2,5 раза меньше, чем в надпочечниках (44, 45). В отделах головного мозга активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы у ежа в 3-4 раза (у кошки – в 4-10 (8)) ниже, чем в гипофизе, и в 2 раза ниже, чем в периферических тканях (13). В порядке снижения активности фермента отделы головного мозга можно расположить следующим образом: 1) у ежа – серое вещество больших полушарий, мозжечок, гиппокамп, гипоталамус, обонятельные доли, стриатум, варолиев мост, продолговатый мозг, четверохолмие; 2) у кошки – серое вещество больших полушарий, мозжечок, гипоталамус, четверохолмие, варолиев мост, белое вещество больших полушарий, спинной мозг; 3) у крысы – гипофиз, обонятельные луковицы, большие полушария, гипоталамус, стриатум, мозжечок, гиппокамп, четверохолмие (8, 12, 13, 44, 45).
Таким образом, в отделах мозга, богатых телами нейронов, активность фермента выше, чем в проводящих путях (8, 13).
Имеются данные о возрастных измене