Структура и регуляция активности ферментов подсемейства 3А цитохрома Р-450

Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных средств на этапе метаболизма возникает при использовании препаратов, способных изменять активность ферментов. Ксенобиотики, какой бы структурой они ни обладали, встречают на своем пути в организме адекватный фермент, переводящий их или в состояние, удобное для использования в качестве энергетического и пластического материала, или в состояние, удобное для выведения из организма. Система биотрансформации ксенобиотиков состоит из ряда ферментных систем, локализованных в межклеточном пространстве, на клеточных и субклеточных мембранах, внутри органелл клетки. При этом процессы биотрансформации весьма сложны и обычно включают ряд последовательных стадий, каждая из которых опосредуется определенным ферментом.

Ферментные системы окислительного метаболизма обнаруживаются практически у всех живых организмов, где они играют важную роль в детоксикации любых эндо - или экзогенных веществ. Из них самой важной и мощной является система цитохрома Р-450 (CYP) (термин "цитохром Р-₄₅₀ " обозначает семейство изоферментов, которые сходны по физико-химическим, каталитическим и молекулярным свойствам.), которая рассматривается как наиболее универсальный биологический катализатор (так называемая "паяльная лампа"). Она объединяет мультигенное семейство гемопротеинов, ответственных за метаболизм многочисленных ксенобиотиков, включая терапевтические препараты, химикалии окружающей среды и диетические компоненты, а также эндогенные вещества, такие как жирорастворимые витамины, билирубин, тироксин, стероиды и желчные кислоты (Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,). Никакая другая ферментная система не может соперничать с цитохромом P450 по диапазону метаболизируемых субстратов, различных по структуре и молекулярному весу – от метанола (MW=42), до циклоспорина А (MW=1203). Эта система представляет собой комплекс ферментов (цитохромы Р450 и b₅, NADPH- и NADH-редуктазы и фосфолипидный компонент мембран) сосредоточенных в мембранах эндоплазматического ретикулума или других компартментах клеток. Основной компонент системы - цитохром Р450, представлен суперсемейством монооксигеназ смешанной функции (MFO), ответственных за I стадию окислительного метаболизма, которая во многом определяет пути биотрансформации ксеноботиков в организме (Н.И. Головенко, 1980; А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Н.В. Адрианов, В.Ю. Уваров,1988; Lewis, Lake, 1997).

Цитохром Р450 (КФ 1.14.14.1) является типичным мембраносвязанным ферментом и большей частью своей молекулы погружен в липидный бислой, а каталитически активная гемовая часть расположена на границе раздела фаз. Проявление активности фермента возможно только в присутствии фосфолипидов или их аналогов, которые стабилизируют цитохром в функционально активной конформации (Н.В. Адрианов, В.Ю. Уваров,1988; В.Ю. Уваров и соавт., 1995; Dai et al., 1998; Yun et al., 1998). Все цитохромы имеют консервативное структурное ядро и вариабельные участки в областях, вовлеченных в узнавание субстрата и связывание редокс-партнера (Peterson, Graham, 1998). Особенности строения гидрофобного субстрат-связывающего кармана определяют субстратную избирательность фермента, поэтому, несмотря на значительную перекрестную специфичность, селективные субстраты и селективные ингибиторы отдельных цитохромов семейства P450 позволяют дать характеристику соответствующих его изоформ (Dai et al., 1998).("Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", Akua Agyeman, B.S., 1990, Seton Hall university). Следует отметить, что из всех компонентов монокосигеназной системы только цитохром Р450 способен активировать молекулярный кислород, передавая ему электроны, полученные от NADPH и (или) цитохрома b₅ (А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Vaz et al., 1996; Coon et al., 1998). Первый электрон поступает на цитохром Р450 от NADPH-редуктазы, второй - от цитохрома b₅. В случае же окисления NADH оба электрона поступают от цитохрома b₅. P450-катализируемая реакция моноокисления есть процесс, при котором один атом молекулярного кислорода реагирует с липофильным субстратом RH и в результате возникает гидрофобный метаболит ROH, вступающий в реакции коньюгирования с ферментами II стадии метаболизма. (Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,) (Рис.1).

Рис. 1 - Фазы окислительного метаболизма ксенобиотиков

Сам механизм монооксигеназной реакции в общих чертах выглядит следующим образом. На первой стадии происходит связывание окисленной формы цитохрома Р450 с субстратом и образование фермент-субстратного комплекса (Fe³⁺RH), существование которого подтверждается тремя типами спектральных изменений. Большинство субстратов вызывают изменения 1-го типа за счет увеличения доли высокоспиновой формы фермента. На второй стадии идет восстановление электроном поступающим от NADPH-редуктазы с образованием восстановленного фермент-субстратного комплекса (Fe²⁺RH). Затем присоединяется молекулярный кислород и образуется оксикомплекс (Fe²⁺О₂RH). На этой стадии может происходить разобщение комплекса в случае переноса электронов на кислород и после диссоциации комплекса возможно образование супероксидного анион-радикала. Для продолжения моноксигеназного цикла необходимо восстановление оксикомплекса вторым электроном и образование пероксикомплекса (Fe²⁺О₂-RH). Затем идет гетеролитический разрыв связи О-О с освобождением воды и образованием комплекса (FeO)³⁺RH, в котором существует электронодефицитный (шестиэлектронный) оксеноидный атом кислорода. Дальнейший механизм окисления субстрата с участием оксена называется оксеноидным.

Возможны три пути взаимодействия оксеноидного комплекса с молекулой субстрата: прямое внедрение кислорода в связь С-Н; отрыв атома водорода от субстрата с образованием радикала субстрата и координированного с железом гидроксильного радикала с последующей рекомбинацией; отрыв гидрид-иона с промежуточным образованием карбониевого иона из молекулы субстрата. По какому конкретному пути пойдет реакция определяется строением субстрата и другими факторами. Оксеноидный комплекс не единственный окислитель, функционирующий в монооксигеназном каталитическом цикле. Такая роль приписывается и другим гипервалентным железо-кислородным комплексам - нуклеофильному пероксижелезу, нуклеофильному или электрофильному гидропероксижелезу, каждый из которых имеет свои пути взаимодействия с субстратом (Vaz et al., 1996, 1998; Coon et al., 1998). Существование различных окислителей в каталитическом цикле обеспечивает вариабельность молекулярных механизмов окисления субстратов, широкую субстратную специфичность монооксигеназ, большое разнообразие продуктов реакции.

Монооксигеназные окислительные реакции повышают полярность гидрофобного субстрата, делают его доступным для действия ферментов конъюгирующих субстрат с глюкуроновой, серной, уксусной кислотами, другими веществами по появившимся или освободившимся в результате окисления полярным группам (II фаза метаболизма ксенобиотиков) (Н.И. Головенко, 1980; А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; K.W. Bock et al., 1990). Конечные продукты окисления и конъюгации, как правило, обладают более низкой биологической активностью и в силу большей растворимости в воде быстрее элиминируются из организма. По отношению к большинству лекарственных веществ и ксенобиотиков техногенного происхождения это означает утрату ими фармакологической активности или токсичности, однако в ряде случаев образуются биологически активные метаболиты, как например, алкилирующие метаболиты многих цитостатиков, активные метаболиты анальгетиков, антиконвульсантов, антиаритмиков, токсические метаболиты канцерогенов, гепатотоксинов (Wolf et al., 1996). Т.о., хотя монооксигеназные реакции по своей сути направлены на защиту живых систем от накопления гидрофобных соединений, они тем не менее представляет определенную опасность для организма, так как неотъемлемой частью каталитического цикла является образование промежуточных активных метаболитов, продуктов неполного восстановления кислорода, которые оказывают повреждающее действие, химически модифицируя макромолекулы, нарушая проницаемость мембран, стимулируя реакции перекисного окисления (А.И. Арчаков, И.И. Карузина, 1988; Chen, Cederbaum,1998; А.И. Арчаков и соавт., 1998).

В ряде случаев особо агресивные свойства образующихся интермедиатов и недостаточная эффективность их обезвреживания служат причиной гепато- и нефротоксичности, мутагенеза, канцерогенеза, тератогенеза, аллергии и других проявлений химически индуцированной токсичности (Рис.20 ("Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", Akua Agyeman, B.S., 1990, Seton Hall university).

Рис. 2 - Баланс между токсификацией и детоксификацией

CYP суперсемейство существует в течение более чем 1,5 миллиарда лет (Рис.3) (3,4).

Рис. 3 - Онтогенез цитохрома P450 (CYP) 3A4 и 3A7 активности

CYP система монооксигеназ, развившаяся, вероятно, в процессе совершенствования метаболизма стероидов как необходимая для сохранения мембранной целостности, впоследствии проявила себя как мощнейший фактор в дезактивации экзогенных соединений (5). Считается, что все гены цитохрома Р450, от бактерий до человека, имеют общего предшественника, который появился более 2 млрд лет тому назад одновременно с появлением кислорода. В процессе эволюции происходило неоднократное разделение филогенетического дерева цитохрома Р450, что отражало состояние антагонизма между животными и растениями (Guengerich, 1992; Archakov, Degtyarenko, 1993; Lewis et al.,1998). Наивысшие концентрации цитохрома Р-450 обнаруживаются в эндоплазматическом ретикулуме или микросомах гепатоцитов, меньшие – в энтероцитах тонкой кишки и еще меньшие – во внепеченочных тканях (почках, легких и мозге) (Gonzalez и другие., 1993; Pollock B. G. et al., 1999). На сегодня обнаружено более 110 семейств цитохрома Р450, множество подсемейств и индивидуальных белков. Клонированы сотни генов различных цитохромов P450 у животных, растений, грибов и бактерий (Porter, 1995; Gonzalez, Lee, 1996). Только у крыс их выделено более 50, а человека известно около 100 цитохромов P450, разделяемых на 17 семейств, кодируемых 48 генами и 10 псевдогенами. (Guengerich F.P., 1992; Beaune P., 1993; Horsmans, 1997;Ross A McKinnon, 2000), которые имеют значительные различия не только в структуре, вопросах активации и регуляции, субстратной специфичности итд, но и в аспектах онтогенеза.

(Saskia N.et all/Cytochrome P450 3A. Ontogeny and Drug Disposition, ClinPharmacokinetlW Dec: 37 (6);) Интересно, что растения имеют большее количество CYP генов, чем животные, из-за большего количества P450-зависимых критических путей метаболизма. Так, рекорд содержания цитохромов принадлежит маленькому растению Arabidopsis thaliana и равен 287, то есть приблизительно 1 % полного генома. (Francois BERTHOU, Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition,)

В структуре всех изоформ цитохрома Р450 имеется консервативный участок вблизи СООН-конца, который содержит 26 аминокислотных остатков. В семейства включают белки, которые имеют около 36% подобия аминокислотного состава, в подсемейства - белки, аминокислотный состав, которых сходен на 65%. Внутри подсемейства белки имеют сходство более чем на 65%). (Akua Agyeman "Effects of administration of cytochrome P450 inhibitors on the P450-mediated metabolism of organophosphorus compounds", , B.S., 1990, Seton Hall university).

И до открытия цитохрома P450, было понятно, что эффективность многих лекарственных препаратов определяется скоростью их биотрансформации организмом. Активность лекарственных средств, метаболизирующихся ферментами печени заметно изменялась, когда животным дополнительно вводились гормоны, инсектициды и канцерогенные вещества – возникающая при этом ферментативная индукция ускоряла биотрансформацию лекарственных препаратов, уменьшая продолжительность и интенсивность их действия (Somogyi A, Kovacs K, Solymoss B, Kuntzman R, Conney AH. 1971. Suppression of 7,12-dimethylbenz(a)anthracene-produced adrenal necrosis by steroids capable of inducing aryl hydrocarbon hydroxylase. Life Sci. 10:1261–71). Характер индукции ферментативной активности определялся типом индуктора, что свидетельствовало о существовании ряда ферментных систем, т.е. что большой спектр каталитической активности обеспечивается множественными ферментами, а не отдельный изоформой (Lu AYH, Somogyi A, West S, Kuntzman R, Conney AH. 1972. Pregnenolone-16-carbonitrile: a new type of inducer of drug-metabolizing enzymes. Arch. Biochem. Biophys. 152:457–62) (Bryan Goodwin, Matthew R. Redinbo, and Steven A. Kliewer, Regulation of CYP3A gene transcription by the PXR Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. 42:1-23).

Всего несколько десятилетий тому в печени крыс, подвергнутых воздействию фенилэтилбарбитуровой кислоты, был идентифицирован первый индуцибельный P450 (теперь классифицируемый как CYP2B) (Gonzalez и другие, 1993) и выдвинут постулат, подтвержденный только недавно, что посредником индукции является рецепторный белок. Позже был идентифицирован второй уникальный P450 (теперь классифицируемый как CYP1A), индуцируемый арилгидрокарбоном и 3-метилхолантреном, и детально описана его регуляция лиганд-активируемым рецептором. В начале 1980-ых, несколько групп исследователей идентифицировали третью форму P450 (теперь классифицируемую как CYP3A), индуцируемую веществами стероидной природы.

Эти исследования обеспечили понимание многих фармакологических, биохимических и биофизических свойств P450 ферментов, включая белковую структуру, специфику субстратов и кинетику фермента. В процессе развития молекулярной биологии стало возможным раскрытие особенностей структуры и функции гена P450, что объяснило феномены наблюдаемые фармакологами в более ранних исследованиях.

Среди цитохромов P450 печени и кишечника человека изоформа CYP3A является наиболее широко представленной составляя примерно 60 % от общего количества цитохромов в данных органах и около 30% - в организме. Она индуцируется многими субстратами, включая естественные и синтетические глюкокортикоиды (дексаметазон, тестостерон, кортизол) 6-beta-гидроксилирование которых она катализирует, прегнан-производные (прегненолон, 16-карбонитрил, прогестерон), антибиотики с макроциклическим лактонным кольцом (рифампицин, эритромицин), цитостатики и многие другие. Ферменты этой группы принимают участие в метаболизме примерно 60% всех лекарственных препаратов и отвечают за возникновение лекарственных взаимодействий практически во всех случаях, когда это касается индукции микросомальных ферментов или их ингибирования (Wrighton и Stevens, 1992; Gonzalez и другие., 1993; Cytochrome P450 enzyme regulation by induction and inhibition, Francois BERTHOU;Ross A McKinnon, Allan M Evans, 2000;).