Порушення обміну оксиду азоту при вазотоксичній дії свинцю та пошук нових засобів біологічної профілактики інтоксикаційПорушення обміну оксиду азоту при вазотоксичній дії свинцю та пошук нових засобів біологічної профілактики інтоксикацій

Державна установа

„ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ АМН УКРАЇНИ”

Апихтіна Олена Леонідівна

УДК 546.81 + 615.9 + 616.13 – 084:001.5

Порушення обміну оксиду азоту при вазотоксичній дії свинцю та пошук нових засобів біологічної профілактики інтоксикацій

14.02.01. – Гігієна та професійна патологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008 рік

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі „Інститут медицини праці АМН України”

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,

академік АМН України,

член-кореспондент НАН України

Трахтенберг Ісак Михайлович,

Державна установа „Інститут медицини праці АМН України”

завідувач лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент АМН України

Яворовський Олександр Петрович

Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця

проректор з навчальної роботи, завідувач кафедри гігієни праці та профзахворювань

доктор медичних наук, професор

Соловйов Анатолій Іванович

Державна установа „Інститут фармакології та токсикології АМН України” завідувач відділу експериментальної терапії

Захист відбудеться „15” вересня 2008 р. о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.554.01 Державної установи „Інститут медицини праці АМН України” (01033, м. Київ, вул. Саксаганського, 75)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи „Інститут медицини праці АМН України” (01033, м. Київ, вул. Саксаганського, 75)

Автореферат розісланий „14” серпня 2008 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради Степаненко А.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На даний час патологія серцево-судинної системи серед причин захворюваності і смертності населення займає чільне місце. Аналіз поширеності артеріальної гіпертензії (АГ) у різних регіонах світу показує, що в індустріально розвинених європейських країнах, а також у США, Японії, Китаї, Росії підвищення артеріального тиску спостерігається у 20-30% населення. Україна належить до країн із високим рівнем захворюваності на АГ – у 34% дорослих чоловіків підвищений рівень АТ (Свищенко Е.П., 2001). При цьому в останні десятиліття відмічається тенденція до раннього розвитку серцево-судинної патології у осіб молодого та середнього віку, що обумовлює значні соціально-економічні втрати (Кундиев Ю.И., 1981; Кундиев Ю.И., Трахтенберг И.М., 2007).

Серед багатьох факторів, які впливають на здоров’я людини та навколишнє середовище, важлива роль належить хімічним забруднювачам (Сердюк А.М., 1998; Трахтенберг И.М., 1998). В останні десятиріччя набула актуальності проблема віддалених наслідків впливу екзогенних хімічних сполук на серцево-судинну систему (ссс). Відмічається пряма залежність функціонального стану системи кровообігу від стажу роботи зі шкідливими хімічними речовинами, а також рівня смертності від серцево-судинних захворювань залежно від тривалості експозиції ксенобіотиків (Зербино Д.Д., 1997).

Серед хімічних речовин, що забруднюють об’єкти зовнішнього середовища важкі метали та їх сполуки утворюють значну групу токсикантів, які, здебільшого, визначають антропогенний вплив на екологічну структуру навколишнього середовища і на людину зокрема. На даний час важкі метали є одними із пріоритетних забруднювачів виробничого і навколишнього середовища, які негативно впливають на здоров’я населення, найбільш токсичним серед них є свинець (Трахтенберг И.М., 2001), який у 1980 році був визнаний ВООЗ одним із глобальних забруднювачів.

На підставі експериментальних, клінічних та епідеміологічних досліджень встановлено, що вплив шкідливих промислових речовин, у тому числі свинцю та його сполук, може як потенціювати ефект різних етіологічних факторів серцево-судинних захворювань та сприяти виникненню останніх (Ахметзянова Э.Х., 2006), так і безпосередньо відігравати провідну роль у їх патогенезі (Трахтенберг И.М., 1992, 2003; Зербино Д.Д., 2002). Частота артеріальної гіпертонії, ішемічної хвороби серця та їх ускладнень, включаючи летальні випадки, значно вища у населення, що проживає у містах із інтенсивним забрудненням атмосфери, порівняно із містами із незначним забрудненням (Трахтенберг И.М., 1992). На цій підставі можна стверджувати, що одним із суттєвих соціально-економічних аспектів проблеми боротьби із захворюваннями ССС є з’ясування ролі професійно-виробничих факторів у розвитку порушень функції серця і судин.

В Інституті медицини праці на протязі трьох останніх десятиліть проводились експериментальні і клінічні дослідження по вивченню впливу важких металів на серцево-судинну систему. Так, Г.Є. Веричем (1989), В.А.

Тичиніним (2003), було показано, що зміни в ССС, які спостерігаються при дії токсичних хімічних речовин, можуть виникати як внаслідок опосередкованого органно-тканинного тропізму та міжсистемної взаємодії, так і завдяки прямій токсичній дії на серце та судини. Виявлено ряд типових кардіовазотоксичних ефектів сполук важких металів, зокрема для свинцю характерними є гіпертензивна реакція, ангіодистонічний синдром, що поєднується із порушенням холестеринового обміну та розвитком атеросклерозу. Співробітниками Інституту сформульовані основні принципи класифікації токсичних речовин за їх дією на серце та судини, а також розроблені методичні вказівки по принципам і методам експериментальної оцінки їх впливу на ССС та методичні рекомендації по прискореній оцінці їх вазотоксичної дії.

Проте, наразі залишаються до кінця не вивченими механізми прямої токсичної дії свинцю на судинну стінку та їх роль у розвитку серцево-судинних захворювань у осіб, які мали виробничо обумовлений контакт зі сполуками свинцю або проживають на забруднених територіях. Із розкриттям ролі ендогенного оксиду азоту в регуляції ССС та значення порушень у його обміні в патогенезі серцево-судинної патології постало нагальним питання можливого залучення зазначеного механізму у порушенні функціональної активності судинної стінки та реалізації вазотоксичної дії свинцю, а також розробки ефективних засобів біологічної профілактики.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом науково-дослідної роботи, яка виконувалась в лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин Інституту медицини праці АМН України „Особливості вазотоксичної дії сполук важких металів – похідних свинцю, ртуті і марганцю – як токсичних факторів малої інтенсивності з урахуванням вікових реакцій” (№ держреєстрації 0104U003076).

Мета досліджень: вивчення в експерименті впливу свинцю на обмін ендогенного оксиду азоту, скоротливу функцію судинної стінки та визначити їх роль у реалізації вазотоксичної дії свинцю, а також оцінка протекторної дії фармакологічного препарату глутаргін та сухого екстракту Serratula coronata.

Щоб реалізувати мету досліджень були поставлені наступні завдання:

1. Оцінити вміст свинцю в крові, аорті, печінці, серці та нирках дослідних щурів після введення ацетату свинцю.

2. Вивчити зміни гематологічних показників, які виникають внаслідок дії свинцю.

3. Дослідити вплив свинцю на рівень тіолових сполук в печінці та генерацію активних форм кисню в аорті і печінці тварин дослідних груп.

4. Визначити зміни показників обміну оксиду азоту в плазмі, еритроцитах, тканинах аорти і печінки дослідних тварин при дії свинцю.

5. Дослідити вплив свинцю на скоротливу функцію судинної стінки на препаратах ізольованого сегменту аорти щурів.

6. Визначити стійкість викликаних свинцем змін досліджуваних показників у експериментальних тварин через 1 місяць після припинення експозиції.

7. На підставі отриманих результатів експерименту розробити додаткові критерії вазотоксичної дії свинцю.

8. Оцінити ефективність протекторної дії препарату глутаргін та екстракту Serratula coronata при експериментальній свинцевій інтоксикації.

Об’єкт дослідження: лабораторні тварини, кров, плазма, еритроцити, гомогенати тканин аорти, печінки, нирок та серця, ізольовані сегменти аорти щурів.

Предмет дослідження: токсична та вазотоксична дія свинцю, протекторна дія глутаргіну та екстракту S. coronata.

Методи дослідження: токсикологічний, хіміко-аналітичний, гематологічні, біохімічні, фізіологічний, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Полягає у комплексному підході до вивчення зрушень в системі оксиду азоту та визначення їх впливу на функціонування судинної стінки при дії свинцю; виявленні стійких та істотних змін біохімічних та фізіологічних показників, викликаних накопиченням свинцю в організмі, визначення їх ролі у розвитку серцево-судинної патології та розробці на їх підставі критеріїв вазотоксичної дії цього металу.

Вперше запропоновано та обґрунтовано доцільність застосування препарату глутаргін у якості засобу біологічної профілактики при дії свинцю та його сполук та доведено його високу ефективність в експериментальних дослідженнях.

Вперше розглядається перспективність застосування рослини S.coronata та препаратів з неї у якості лікувально-профілактичного засобу при екологічно та виробничо обумовлених патологічних станах. Експериментально доведена висока ефективність сухого екстракту S.coronata при свинцевій інтоксикації.

Теоретична значення одержаних результатів полягає у з’ясуванні механізмів розвитку вазотоксичної дії свинцю, участі у цьому процесі змін в системі оксиду азоту, а також в обґрунтуванні на їх основі протекторної дії запропонованих препаратів у якості лікувально-профілактичних засобів при свинцевій інтоксикації.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень можуть бути використані токсикологами, біологами, фармацевтами та фармакологами, а також фахівцями, які здійснюють профілактику та лікування свинцевої інтоксикації. Розроблені додаткові критерії вазотоксичної дії свинцю та запропонований метод експериментальної оцінки вазотоксичної дії свинцю можуть застосовуватись у токсиколого-гігієнічних дослідженнях. Отримані експериментальні дані відображені у розроблених за участю автора інформаційного листа „Патогенетично обґрунтовані критерії кардіо-вазотоксичної дії свинцю” (№ 050-07) та патентах „Спосіб експериментальної оцінки вазотоксичної дії свинцю” (№ 26627 від 25.09.2007), „Спосіб профілактики та лікування свинцевої інтоксикації”( №26628 від 25.09.2007), „Спосіб застосування екстракту S. coronata для профілактики та лікування свинцевої інтоксикації” (№26997 від 10.10.2007).

Особистий внесок здобувача. Автором обрано і обґрунтовано напрямок наукової роботи, виконано патентно-інформаційний пошук по даній проблемі, проведено постановку та планування експерименту, здійснено моделювання свинцевої інтоксикації у дослідних тварин, проведено гематологічні дослідження та вивчення скоротливої функції судинної стінки. Спільно із с.н.с. Інституту біохімії НАНУ А.В. Коцюрубою проведено біохімічні дослідження, спільно із с.н.с. Інституту медицини праці І.М. Андрусишиною визначено вміст свинцю у біологічних середовищах дослідних тварин. Автором дисертації проведена статистична обробка даних та аналіз отриманих результатів досліджень, розроблені додаткові критерії вазотоксичної дії свинцю, обґрунтовано та експериментально доведено доцільність застосування глутаргіну та екстракту S.coronata у якості лікувально-профілактичних засобів при свинцевій інтоксикації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали даної дисертаційної роботи були представлені та обговорені у доповідях на конференціях молодих вчених Інституту медицини праці АМНУ (2004-2007рр.), в матеріалах науково-практичної конференції „Глутаргін у клініці внутрішніх хвороб” (Харків, 2005), ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів „Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005), 10-й Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология – наука ХХІ века” (Російська Федерація, Пущіно, 2006), ІІ конгресі фармакологів (Одеса, 2006), науково-практичному семінарі „Серцево-судинні захворювання – 2006” (Київ, 2006), міжнародній науковій конференції „Лекарственные средства и биологически активные соединения” (Білорусія, Гродно, 2007), III міжнародній науковій конференції „Актуальные проблемы экологии – 2007” (Білорусія, Гродно, 2007).

Публікації. За результатам дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць, у тому числі 3 статті у наукових фахових журналах, що входять до переліку ВАК України, 7 – у тезах конгресів, з’їздів, конференцій. Отримано 3 патенти України на корисну модель, видано інформаційний листок.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку літератури. Загальний обсяг дисертації становить 235 сторінок комп’ютерного друку. Дисертація ілюстрована 65 рисунками та 7 таблицями. Бібліографія включає 356 джерел, з них 164 іноземних найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводили у субхронічному експерименті (1 міс. затравки) на статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар вагою 160-185 г. після проходження ними 14-денного карантину. Тварини утримувались у загальноприйнятих умовах віварію із вільним доступом до питної водогінної води по 8-10 тварин у кожній групі. Групи дослідних щурів, шлях введення та доза застосованих препаратів подано у таблиці 1. Усього в експерименті використано 140 тварин.

Екстракт, що містив 5 % екдістероїдів, готували із надземної частини у фазі цвітіння рослини S. coronata , яка була вирощена на дослідних ділянках в національному парку „Олександрія” (м. Біла Церква). Екстракцію, ідентифікацію і ліофілізацію проводили за методикою Ю.Д. Холодової на базі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.

Таблиця 1. Групи дослідних щурів.

Примітка: в/о – внутрішньоочеревинний шлях введення, фіз. р-н – фізіологічний розчин.

Після припинення експозиції половину тварин знеживлювали шляхом декапітації та проводили дослідження, а решту утримували в умовах віварію 1 місяць, після чого теж знеживлювали. Після декапітації забирали кров та одразу видаляли внутрішні органи.

Концентрацію свинцю у біологічних середовищах щурів визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії в полум’ї.

Дослідження кількості еритроцитів та гемоглобіну проводили фотоколориметричним методом, розрахунок лейкоцитарної формули, кількості ретикулоцитів, еритроцитів з базофільною зернистістю здійснювали по загальноприйнятій методиці. Визначення стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу проводили кінетичним методом.

Біохімічні дослідження, що характеризують стан окисного метаболізму та обмін оксиду азоту, проводили у плазмі, еритроцитарному концентраті, гомогенатах тканин печінки і аорти.

Рівень загальних вмісту тіолових сполук в гомогенаті печінки оцінювали з реактивом Елмана (Ellman G.I., 1959), рівень небілкових (низькомолекулярних) тіолів визначали після осадження трихлороцтовою кислотою. Вміст пероксиду водню (Н₂О₂) визначали спектрофотометрично після додавання аліквоти проб до розчину йодиду калію (0,1 моль) із надлишком лактопероксидази (50 нмоль) у фосфатному буфері (0,05 моль) при довжині хвилі 353 нм (Huwiler M., 1984). Рівень генерації супероксид-аніону у пробах оцінювали по зміні екстинції при 550 нм за окисленням цитохрому С у 10 ммоль тріс-буфері після інкубації сумішей при 37 °С протягом 30 хв (Mc. Cord J., 1982). Визначення рівнів генерації ОН-радикалу проводили в інкубаційній суміші по приросту малонового діальдегіду (Conte D., 1996).

Активність сумарної NOS визначали за вмістом новоутвореного нітрит-аніону колориметричним методом (Vodovotz Y., 1994; Green L.C., 1982). Інкубаційна суміш складалась з 50 ммоль фосфатного буфера (рН 7,4), 1,25 ммоль CaCl₂, 1 ммоль NADPH, 1 ммоль L-аргініну. Для визначення іNOS в інкубаційну суміш замість CaCl₂ додавали 0,1 ммоль ЕДТА. Розрахунок активності сNOS проводили шляхом віднімання від показника активності сумарної NOS показник активності іNOS. Вміст нітрит-аніону (NO₂^-‾) визначали в безбілкових аліквотах гомогенатів чи надосадових проб після визначення активності NO-синтази у колориметричній реакції за допомогою реактиву Гріса методом Гріна (Green L.C., 1982). Вміст нітрат-аніону (NO₃^‾) визначали спектрофотометричним методом (Isukahara H., 1996) у модифікації з бруцином. Концентрацію низькомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ) визначали в безбілковій кислоторозчинній фракції за методикою визначення NO₂^- з модифікованим реактивом Гріса, що містив катіони Нg²⁺ (2,5 % Hg²⁺ в 4 % розчині Н₃РО₄) (Padgett C. M., 1998). Визначення високомолекулярних нітрозотіолів (ВМНТ) проводили за методикою визначення NO₂^- в білкових аліквотах після гідролізу проб протягом 18 годин при кімнатній температурі у присутності катіонів Нg²⁺ (Padgett C. M., 1998). Визначення нітратредуктазної активності проводили за змінами вмісту субстрату субстрату – нітрат-анону- в натрій-фосфатному (20 ммоль/л рН 7,4) в присутності надлишку NADH (Li H., 2001). Активність аргінази визначали спектрофотометричним методом за вмістом сечовини (Garganta C. L., 1982). Концентрацію сечовини оцінювали в безбілкових пробах колориметричним методом з набором реактивів фірми LAСHEMA. Вміст загального білку в пробах визначали загальновідомим методом Бредфорд.

Дослідження скоротливої функції аорти проводили на препаратах ізольованих сегментів грудного відділу аорти експериментальних тварин (щурів) (Соловйов А.І., 2000; Ткаченко М.М., 2002). Після видалення аорту нарізали на сегменти шириною близько 1,5 – 2 мм (маса близько 2 мг) під кутом 45° із урахуванням циркулярної орієнтації гладком’язевого шару. Препарат ізольованого сегменту аорти поміщали в проточну термостатовану (36° С) камеру в стандартний розчин Кребса (NaCl – 133,0; KCl – 4,7; NaHCO₃ – 16,3; NaH₂PO₄ – 1,38; CaCl₂ – 2,5; MgCl₂ – 1,05; глюкоза – 7,8 ммоль/л; рН 7,4), де його піддавали розтягненню з силою 10 мН і витримували протягом 30-40 хв. Скорочувальну активність гладеньких м’язів (ГМ) аорти реєстрували за допомогою механоелектричного перетворювача 6МХ1С в режимі, що наближався до ізометричного. Активацію ГМ проводили додаванням до буферного розчину норадреналіну (НА, “Sigma”, США). Ендотелійзалежні та ендотелійнезалежні реакції досліджували по зміні тонічного напруження ГМ на ендотелійзалежний агоніст мускаринових рецепторів ацетилхолін гідрохлорид (“Flьka”, Швейцарія) та ендотелійнезалежний агоніст нітропрусид натрію (“Sigma”, США). Зміну амплітуди тонічного напруження вимірювали у відсотках відносно до їх сталого скорочення на НА (скорочення на НА приймали за 100%).

Обсяг проведених досліджень приведено у табл. 2. Результати обробляли методом варіаційної статистики, використовуючи програмне забезпечення Origin 6.0 фірми “Microcal Software, Inc” (США).

Таблиця 2. Обсяг проведених досліджень.

Результати досліджень та їх обговорення. При дослідженні вмісту свинцю в крові та органах дослідних щурів виявлено, що після 28 введень ацетату свинцю у дозі 1,53 мг/кг спостерігалось його накопичення в нирках і аорті та, меншою мірою, в крові, серці, печінці (Табл. 3).

У постекспозиційному періоді у щурів, яким вводили ацетат свинцю, виявлено зниження концентрації свинцю в крові та внутрішніх органах, особливо в аорті та нирках, порівняно із першим періодом досліджень, що пов’язано з перерозподілом даного металу, депонуванням та виведенням його із організму тварин після припинення експозиції.

Застосування глутаргіну та екстракту S. coronata у щурів дослідних груп на фоні експозиції ацетатом свинцю, порівняно із групою тварин, якій вводили лише свинець, сприяло зниженню вмісту цього металу в аорті, печінці, та, особливо, в нирках і не впливало на його концентрацію в крові. У постекспозиційному періоді у тварин цих дослідних груп зниження вмісту свинцю у біосередовищах спостерігалося лише в нирках.

Таблиця 3. Вміст свинцю в органах та крові дослідних щурів (М ± m, n=10).