Ферритин как маркер железодефицитной анемии и опухолевый маркер

Андреев Г. И. магистр техники и технологии, выпускник (2003 г.) СПбГПУ, факультет медицинской физики и биоинженерии, кафедра физико-химических основ медицины.

Железодефицитной анемией (ЖДА) и скрытыми формами дефицита железа страдает 50-80% населения России. Определение концентрации ферритина в сыворотке крови позволяет эффективно дифференцировать ЖДА от других типов анемий. Высокие концентрации ферритина характерны для воспалительных и инфекционных процессов, некоторых онкологических заболеваний.

В статье описаны структура и функции ферритина, его роль в метаболизме железа, характерные для разных состояний изменения его концентрации в крови, дан сравнительный анализ характеристик ИФА-наборов зарубежных производителей и первой российской тест-системы.

Ferritin as a marker of iron-deficiency anemia and oncomarker.

Andreev G. I. (egor67@mail.ru), magister of technology (2003), Saint Petersburg State Polytechnic University.

Key words: iron metabolism, ferritin, iron-deficiency anemia, oncomarkers, enzyme immunoassay.

There are 50-80% of population of Russia are suffering from iron-deficiency (IDA) and latent forms of iron deficiency. Determination of ferritin concentration in serum allows to differentiate efficiently IDA from other forms of anemia. High ferritin levels may be associated with inflammation and infectious diseases, certain malignancies.

The article describes structure and functions of ferritin, its role in iron metabolism, changes of its serum concentration, corresponding to different physiological states. The comparison of characteristics of the first Russian EIA kit and some foreign ones is given.

Введение

Ионы железа выполняют в организме человека очень важную функцию. Они входят в состав белков, осуществляющих перенос кислорода, цитохромов и железосеропротеинов, железосодержащих ферментов. Поэтому недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них является развитие железодефицитной анемии (ЖДА). Согласно данным ВОЗ, от скрытого дефицита железа и ЖДА страдает около одной трети населения планеты. В некоторых регионах России этот показатель достигает 70-80%. Проявления данного заболевания разнообразны и иногда приводят к тяжелым последствиям.

Избыточное содержание железа в организме также опасно. Оно приводит к развитию токсикозов, патологическому повышению уровня активных форм кислорода.

Вследствие этого важно иметь интегральный показатель оценки содержания железа в организме. Высокоинформативным маркером, характеризующим метаболизм железа, является ферритин.

Для определения содержания ферритина в сыворотке крови используются иммунометрические методы. В связи с поливалентностью данного антигена можно создать специфические и высокочувствительные системы определения его концентрации. В России в настоящее время определение ферритина в лабораторной практике распространено очень слабо. Это объясняется недостаточной информированностью населения и медицинского персонала о диагностической значимости данного показателя, а также сравнительно высокой стоимостью проведения анализа при помощи наборов реагентов зарубежных производителей. Первая в нашей стране иммуноферментная система для определения концентрации ферритина в сыворотке крови человека, основанная на применении моноклональных антител, разрабатывается в аналитической лаборатории ЗАО "Алкор Био".Для успешного применения в лабораторной практике создаваемый продукт должен удовлетворять всем требованиям к его качеству, не уступать по аналитическим характеристикам зарубежным аналогам, а также обладать стоимостью, обеспечивающей возможность проведения регулярных скрининговых обследований.

1. Актуальность проблемы

Ферритин - растворимый в воде комплекс гидроксифосфата железа с белком апоферритином. Наибольшее его количество находится в клетках печени, селезенки, костного мозга и ретикулоцитах, где наиболее интенсивно проходят процессы синтеза, созревания и деградации эритроцитов и ферритин активно участвует в метаболизме и перераспределении железа в организме.

Способность синтезировать ферритин появилась у клеток на ранних этапах эволюции. Характерные аналоги ферритина найдены у грибов, бактерий, растений. У животных ферритин обнаружен в тканях аннелидовых червей, моллюсков, насекомых, рыб, амфибий и млекопитающих (1, 2, 3). У позвоночных защита от токсического эффекта железа и активных форм кислорода осуществляется двумя железосвязывающими белками: внеклеточными трансферринами и внутриклеточными ферритинами. Оба сохраняют железо в безопасной окисленной форме Fe(III), которая не катализирует продукцию свободных радикалов. Ферритин содержит 15-20% общего количества железа в организме.

Концентрация ферритина в сыворотке крови позволяет оценить общие запасы железа в организме (4). У здоровых людей содержание ферритина в плазме крови составляет 20-350 нг/мл. Падение концентрации ниже 10 нг/мл свидетельствует о развитии железодефицитной анемии, в то время как при избыточном накоплении железа концентрация ферритина может возрастать до нескольких тысяч нг/мл.

Железодефицитная анемия является самым распространенным анемическим синдромом и составляет приблизительно 80% заболеваемости всеми видами анемий. Ее распространенность определяется физиологическими, патологическими, экологическими и социальными факторами. Предполагают, что в мире страдает железодефицитной анемией около 1,8 миллиарда человек (ВОЗ, 1998). Согласно данным ВОЗ (1992), дефицит железа определяется как минимум у 20-25 % всех младенцев, у 43 % детей в возрасте до 4 лет и 37 % детей от 5 до 12 лет. Даже в развитых странах эти цифры не ниже 12 % у детей до 4 лет и 7 % детей в возрасте от 5 до 12 лет (5).

Из-за физиологических ежемесячных кровопотерь и вынашивания детей более чем у 51 % женщин детородного возраста во всем мире обнаруживается нехватка железа вплоть до отсутствия его запасов. Дефицит железа в III триместре беременности обнаруживается почти у 90% женщин и сохраняется после родов и лактации у 55% из них (5).

В России частота железодефицитной анемии приближается к показателю стран третьего мира. В некоторых регионах России (Север, Восточная Сибирь, Северный Кавказ) скрытый дефицит железа выявляется у 70-80% жителей. Это связано и с неблагоприятной экологической обстановкой, и с нерациональным питанием, вызванным снижением уровня жизни.

Негативные проявления данного заболевания разнообразны и тяжело переносимы. Это синдром хронической усталости, внезапная потеря сознания, нарушения менструального цикла, дизурические расстройства, извращение вкусовых ощущений, нарушения психики. ЖДА является отягощающим фактором при заболеваниях сердечно-сосудистой и пищеварительной систем. У детей анемии часто являются причиной замедления умственного и физического развития, снижения успеваемости. Взрослые страдают от мышечной слабости, длительной ремиссии после перенесенных инфекций, что приводит к экономическим потерям. Кажущаяся странность, несерьезность симптомов (сонливость, быстрая утомляемость) заставляют людей долгое время не обращаться к врачу с четкими жалобами, а приспосабливаться к болезни. Патология же прогрессирует и в итоге может привести к серьезным, порой необратимым нарушениям функций организма. Так, анемии являются частой причиной внутриутробной смерти плода, низкого веса новорожденных, они обуславливают до 20% материнских смертей (6).

В настоящее время общепринято, что диагноз железодефицитных состояний надо ставить до развития полной картины заболевания, т.е. до возникновения гипохромной анемии. При дефиците железа страдает весь организм, а гипохромная анемия - это поздняя стадия болезни.

В 1983 г. П. М. Альперин и Ю. Г. Митерев предложили новую классификацию форм железодефицитной анемии, которая в полной мере отражает все основные этиологические факторы, приводящие ее к развитию. Они выделяют:

постгеморрагические анемии;

нутритивные (алиментарные) анемии;

анемии при повышенном расходе железа в организме (например, при беременности, лактации, росте и созревании);

железодефицитные анемии при исходно недостаточном уровне железа;

железодефицитные анемии при его недостаточной резорбции (например, постгастрорезекционные, агастральные, анэнтеральные);

при перераспределении железа в результате инфекции, при воспалительных и опухолевых процессах;

при нарушении транспорта железа (например, гипотрансферринемические и атрансферринемические).

Регулярное определение ферритина используется для отслеживания быстрого истощения запасов железа во время беременности, у доноров крови и у пациентов, регулярно подвергающихся гемодиализу. Оно также имеет ценность для диагностики гемохроматозов, при мониторинге пациентов, которые регулярно подвергаются переливанию крови или железозаместительной терапии и составляют группу риска по аккумулированию избыточных запасов железа. Концентрация ферритина может повышаться при некоторых острых и хронических заболеваниях печени, при голодании и истощении, наличии воспалительных процессов, инфаркте миокарда. Можно использовать определение ферритина для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.

К современным методам ранней диагностики железодефицитных состояний (гипосидероза) относятся определение концентрации железа в сыворотке, общей железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС), трансферрина и ферритина в сыворотке. Показатели метаболизма железа при различных видах анемий представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Показатели обмена железа в норме и при различных видах анемий (Авцын А. П., 1990).

Избыточное содержание железа в организме называют сидерозом или гиперсидерозом.

В 1971 г. Dagg e. a. предложили клиническую классификацию гиперсидерозов. Различают следующие формы гиперсидероза:

паренхиматозные формы (с преимущественным отложением железа в клетках паренхимы печени). К ним относятся: первичный наследственный гемохроматоз, сидероз при некоторых видах цирроза печени, вторичный сидероз при портокавальном анастомозе, сидероз при врожденной атрансферринемии;

"ретикулоэндотелиальные" формы, к которым относятся: генерализованные отложения железа при хронических рефрактерных (к специфическому лечению) анемиях, гемолитических анемиях, многократных гемотрансфузиях, при избыточном парентеральном введении железа, сидерозе банту;

локальные формы: идиопатический гемосидероз легких, легочно-почечный синдром Гудпасчера и гемосидероз почечного происхождения при ночной пароксизмальной гемоглобинурии.

При этих патологических состояниях концентрация ферритина в плазме крови повышена вследствие нарушения баланса обмена железа.

В то время как истощение запасов железа в организме является единственной причиной снижения уровня сывороточного ферритина, повышение уровня ферритина наблюдается не только при избытке запасов железа, но также в некоторых других ситуациях.

Определение ферритина можно использовать для диагностики и мониторинга ряда онкологических заболеваний. Ценность определения ферритина как онкомаркера подтверждают многие исследования (7, 8).

Высокие концентрации ферритина обнаруживаются в сыворотке пациентов с карциномой поджелудочной железы, раком легких, гепатомой и нейробластомой, острым миелобластным и лимфобластным лейкозами, лимфогранулематозом (болезни Ходжкина). Концентрация сывороточного ферритина обычно повышена при метастазирующем раке молочной железы. При онкологических заболеваниях концентрация ферритина в крови повышена как вследствие его активной секреции, так и за счет повышенного распада клеток и высвобождения цитоплазматического ферритина, например, при химиотерапии. После успешного лечения концентрация ферритина в сыворотке крови снижается.

Концентрация ферритина может также повышаться при некоторых острых и хронических заболеваниях печени (например, алкогольное поражение, гепатит), при голодании и истощении, воспалительных заболеваниях (легочные инфекции, остеомиелит, хронические инфекции мочевых путей, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, ожоговая болезнь), инфаркте миокарда (8, 9). В этих случаях основной причиной увеличения содержания ферритина в крови является некроз клеток и высвобождение внутриклеточной фракции.

Определение ферритина в клинической практике позволяет улучшить диагностику нарушений метаболизма железа. Несомненными достоинствами метода являются также малая инвазивность и простота выполнения. Однако правильная интерпретация результатов требует ясного понимания как процессов метаболизма железа, так и учета других влияющих на уровень сывороточного ферритина факторов, например поражения печени или воспалительных процессов.

В настоящее время многие зарубежные производители предлагают наборы реагентов для иммуноферментного определения содержания ферритина в сыворотке, однако они очень мало распространены в России вследствие высокой стоимости и недостаточной информированности как медиков, так и населения о диагностической значимости данного показателя. Таким образом, необходимость разработки отечественной тест-системы для определения концентрации ферритина в крови человека очевидна.

2. Метаболизм железа в организме человека

Общее содержание железа в организме здорового взрослого человека составляет 3-5 г (у женщин часто меньше). 70% от этого количества входит в состав гемоглобина и 15-25% - ферритина и гемосидерина. Оставшаяся часть приходится на мышечный миоглобин (8%), цитохромы и железосеропротеины, выполняющие функцию транспорта электронов в митохондриях, и железосодержащие ферменты (оксидазы, супероксиддисмутазы, каталазы) (10).

В сутки в организм с пищей поступает 1-2 мг железа. Наиболее интенсивное всасывание осуществляется в 12-перстной и тощей кишке и отсутствует в подвздошной. Усвояемость железа ограничена и определяется многими факторами, например, составом пищи, состоянием желудочно-кишечного тракта. Всасывание и транспорт железа к клеткам осуществляют трансферрины - белки бета-глобулиновой фракции, синтезируемые печенью. Различают две формы трансферринов. Мукозный трансферрин секретируется с желчью в кишечник, где окисляет и связывает один или два атома железа и проникает в энтероцит. На базальной стороне клетки он отдает железо ферритину или своему аналогу - плазматическому трансферрину.

Плазматический трансферрин, "нагруженный" железом, разносится с током крови по организму. При взаимодействии трансферрина со своим специфическим рецептором на поверхности клеточных мембран образуется эндоцитозная вакуоль, внутри нее происходит изменение рН, и железо, меняя степень окисления +3 на +2, освобождается от трансферрина. Белок вновь возвращается в кровеносное русло, а железо немедленно связывается низкомолекулярными хелаторами, такими как цитрат или аскорбиновая кислота. После этого железо может быть использовано для синтеза гемоглобина и железосодержащих ферментов или заключено для хранения в ферритин.

В организме человека происходит постоянное перераспределение железа.

В количественном отношении наибольшее значение имеет метаболический цикл (1): плазма --» красный костный мозг --» эритроциты --» плазма. Кроме того, функционируют циклы (2): плазма --» ферритин, гемосидерин --» плазма и (3): плазма --» миоглобин, железосодержащие ферменты --» плазма. Все эти три цикла взаимосвязаны через плазматический трансферрин. Единовременно он связывает лишь 3 мг железа, но ежедневный обмен железа через него в 10 раз больше. Трансферрин, таким образом, играет центральную роль в "круговороте" железа в организме.

Возможность выделительной системы человека экскретировать железо из организма ограничена. В день теряется около 1 мг железа, в основном путем слущивания слизистой оболочки кишечника и с желчью. Примерно 0,1 мг выводится с мочой, потом, волосами и ногтями. Потеря 15-30 мл крови ведет к потере 7,5-15 мг железа. Для хранения невыведенного избытка железа его необходимо конвертировать в удобную форму.

Свободные ионы железа могут образовываться в клетке при переносе между трансферрином и низкомолекулярными хелаторами, ферритином и хелаторами, хелаторами и митохондриями, при деградации ферритина в лизосомах, при избыточном накоплении гемосидерина. Несвязанное железо вместе с супероксид-радикалом, который восстанавливает Fe(III) (уравнение 1), и перекисью водорода, образующейся в ходе реакции Фентона (уравнение 2), поставляют высоко реакционноспособные гидроксильные радикалы. Суммой этих двух реакций является так называемая реакция Габера-Вейса (уравнение 3). Fe(III), получающееся при реакции Фентона (уравнение 2), также может быть восстановлено аскорбатом, что ведет к дальнейшей продукции радикалов.

Обладающий высочайшей активностью гидроксильный радикал вызывает перекисное окисление липидов, разрывы нитей ДНК и деградацию других биомолекул. С его действием сейчас связывают развитие нейродегенеративных и опухолевых заболеваний (11).

Таким образом, ионы железа постоянно находятся в связанной форме. Главные органы, выполняющие функцию хранения железа, - это печень, которая содержит около 700 мг железа, селезенка и костный мозг. Мышцы также важны из-за их большой массы, хотя реальная концентрация хранимого в них железа низкая - 40 мг/кг.

3. Структура и функция молекулы ферритина.

Молекула ферритина образована Н- и L- типами субъединиц (Н - heavy и L - light), кодируемых разными генами. Человека имеет около 16 копий Н-гена и около 5 копий L-гена, локализованных на различных хромосомах. Однако большинство из них являются безинтронными псевдогенами. Функционально активные Н- и L-гены человека располагаются в 12-13 сегменте длинного плеча 11 хромосомы и 13 сегменте длинного плеча 19 хромосомы соответственно. Ген L-цепи состоит из 878 пар азотистых оснований, Н-цепи - из 801 пары. Известна структура Н- и L-генов человека. Все они содержат три интрона различной длины. 5'-фланкирующие области генов Н- и L-цепей не имеют сходства, тогда как среди гомологичных цепей различных видов сохраняется высокая степень консервативности (12, 13, 14).

У человека аминокислотные последовательности Н и L идентичны на 54%. Аспартат, глутамат и их амиды составляют около 25% аминокислотных остатков, лизин и аргинин - 11-13%. Высоко содержание лейцина, но мало содержание изолейцина. У млекопитающих значительно варьирует содержание серина, пролина, глицина, лейцина, тирозина, фенилаланина и аргинина. Полипептидная цепь Н-типа человека состоит из 183 аминокислотных остатков, ее молекулярная масса 21 кДа. Молекулярная масса L-субъединицы, состоящей из 175 аминокислот, около 19 кДа.

Вторичная структура субъединиц почти на 70% представлена альфа-спиралями.

Третичная структура субъединиц животных и растений намного более консервативна, чем их первичная последовательность (15). Каждая субъединица образована пучком из четырех длинных спиралей, расположенных параллельно, пятой короткой спирали, пересекающей ось субъединицы примерно под углом 60º и длинной вытянутой петли (общие размеры 25×25×50 ангстрем) (рис. 2).

Структура субъединиц стабилизируется лишь водородными связями, дисульфидные связи не обнаружены.

Каждая молекула апоферритина собрана из 24 структурно равнозначных субъединиц, вносящих одинаковый вклад в формирование четвертичной структуры. В 24-мерах смешанного состава (гетрополимерах) Н- и L- субъединицы имеют одинаковую конформацию и много сходных остатков в областях H-H, H-L и L-L межсубъединичных контактов, предоставляя возможность формирования гетерополимеров с любой из возможных композицией субъединиц.

Сборка целой молекулы апоферритина происходит следующим образом: первоначально формируются димеры из противоположно направленных субъединиц. Высокая эффективность формирования димеров обусловлена образованием большого числа гидрофобных связей. Далее 12 пар димеров ассоциируют с образованием цельной молекулы апоферритина, способной инкорпорировать железо. Субъединицы организованы таким образом, чтобы образовать полую, симметричную глобулу с наружным и внутренним диаметрами 125 и 80 ангстрем соответственно (16, 17).

Ближайшие к нам субъединицы изображены толстыми лентами, внутри глобулы в центре видно железосодержащее ядро.

Бислой альфа-спиралей перпендикулярен радиус-вектору белковой молекулы. Каждая субъединица контактирует в апоферритине с пятью соседними. Длинная петля, почти лишенная вторичной структуры, расположена на внешней поверхности молекулы. Кроме того, молекулы ферритина могут образовывать суперолигомеры - димеры и тетрамеры (18).

Субъединицы плотно упакованы, за исключением того, что в местах контакта трех субъединиц есть узкие каналы диаметром около 1 нм, пронизывающие глобулу. У ферритинов высших организмов вокруг этих осей третичной симметрии локализуются преимущественно гидрофильные остатки. В субъединицах ферритина позвоночных и растений боковые цепи, формирующие наиболее узкие части каналов на краю, открывающемся в полость молекулы, высоко консервативны. Это 3 симметрично расположенных аспартата и 3 глутамата. Каналы, проходящие вдоль осей третичной симметрии, являются главным входным путем для железа и сайтами окисления Fe(II) (19).

Внутренняя поверхность четвертичной складчатости, выстланная остатками 12 лейцинов высоко гидрофобна у L-ферритинов млекопитающих. В Н-цепях на стороне полости находятся 4 гистидина и обычно 4 лейцина на наружной поверхности.

Все молекулы ферритинов имеют полость для хранения железа. Несмотря на то, что внутренняя поверхность участвует в формировании железосодержащего ядра, ее аминокислотные остатки не высоко консервативны среди млекопитающих. Полагают, что главным фактором, определяющим формирование ядра, является распределение зарядов на внутренней поверхности.

Ферритины, изолированные из тканей млекопитающих, состоят из смеси изоферритинов с широким спектром состава субъединиц и содержания железа (20, 21). Возможны 25 изоферритинов с соотношением субъединиц: Н24L0, H23L1, H22L2 … H0L24, но в основном спектр распределения субъединиц в изоферритинах заключен в пределах H22L2 - Н2L22. Обычно ферритины с преобладанием L-субъединиц характерны для органов, запасающих железо (печень и селезенка), и эти ферритины обычно имеют относительно высокий средний уровень содержания железа (более 1500 атомов Fe на молекулу). Богатые Н-субъединицами ферритины, характерные для сердца и мозга, имеют низкое содержание железа (менее 1000 атомов Fe на молекулу).

Вследствие различий по составу субъединиц молекулярная масса изоферритинов колеблется от 440 кДа у легких фракций изоферритинов селезенки до 500 кДа у тяжелых мышечных ферритинов. Общая молекулярная масса ферритина может удваиваться за счет включения кластера железа и достигать 900 кДа (22). Однако ферритины обычно не полностью насыщены железом и обладают молекулярной массой, промежуточной между апоферритином и полностью заполненным холоферритином.

L-цепи являются более щелочными по сравнению с Н-цепями. Вследствие этого богатые Н-субъединицами ферритины эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов, мышц, тимуса, мозга и других тканей обладают изоэлектрической точкой в диапазоне 4,5-5,0, а ферритины печени и селезенки с преобладанием L-субъединиц имеют pI 5,3-5,8 (23).

Субъединицы ферритинов содержат небольшое число углеводородов. Состав и количество сахаров сильно варьируют в зависимости от видовой и тканевой принадлежности, но у человека суммарно они составляют 2,4% массы апоферритинов печени и селезенки и около 5% у сердечных изоформ (24).

В отличие от высоко консервативной белковой глобулы, структура железосодержащих ядер довольно вариабельна, в том числе вследствие различий в составе, особенно в содержании неорганического фосфата (25). Большая минеральная структура не имеет какой-либо преимущественной ориентации по отношению к белковой оболочке, хотя аминокислотные остатки на ее внутренней поверхности считаются важными для нуклеации. Нативные ядра человеческом ферритине - ферригидриты (5Fe2O3· 9H2O) с различной степенью кристалличности. Каждый атом Fe(III) окружен приблизительно шестью атомами кислорода на расстоянии 1,93 ангстрем. Нативные ферритины содержат неорганический фосфор, его содержание колеблется в пределах 10-40 атомов Fe на 1 атом Р в зависимости от уровня запаса железа (26).

Проникновение атомов железа в полость белковой глобулы и формирование железосодержащего кластера требует предварительного окисления двухвалентного железа до трехвалентного (27).

Работы, выполненные на рекомбинантных ферритинах, содержащих субъединицы одного типа, свидетельствуют о том, что ферроксидазная активность связана с Н-цепями. L-цепи в ферритинах позвоночных лишены внутрисубъединичных ферроксидазных центров (28). Несмотря на это, ферритин селезенки с высоким процентом L-цепей (85%) имеет высокое содержание железа (в среднем 2700 атомов на молекулу). Рекомбинантные L-гомополимеры человека при экспрессии в E. coli связывают менее 10 атомов Fe на молекулу, в то время как Н-гомополимеры при тех же условиях аккумулируют до 200-300 атомов.

Эти экспериментальные наблюдения привели к заключению, что L-цепи лучше для нуклеации ферригидрита. Возможным объяснением этому может быть то, что их поверхности, обращенные в полость, имеют больше карбоксильных лигандов, чем Н-цепи. Слабая феррроксидазная активность L-цепей может быть объяснена наличием альтернативного сайта окисления Fe(II), образованного His136 и Asp139 в качестве лигандов металла (29). Напротив, Н-ферритины - относительно слабые ядрообразователи. Электронная микроскопия свидетельствует, что ядра рекомбинантных L-ферритинов и нативных гетерополимеров крупнее и регулярнее, чем у Н-ферритинов (30). Н-цепи необходимы для быстрого окисления поступающего железа.

Функции двух типов цепей взаимно дополняют друг друга. Кинетика накопления и высвобождения железа оптимальна при определенном количественном соотношении между двумя субъединицами. В экспериментах с Н/L гетерополимерами, реорганизованными в разных пропорциях, показано, что железо инкорпорировалось оптимально в молекулах, содержащих от 5 до 8 Н-цепей, что соответствует составу изоферритинов селезенки и печени (31).

Возможным объяснением того, что изоформы, наиболее интенсивно инкорпорирующие железо, практически никогда не насыщены железом полностью, также является стремление сохранить условия, при которых скорость процессов обмена железа максимальна. Экспериментально установлено, что первоначальные этапы нуклеации (формирования центров роста кристаллов) и роста ядер протекают относительно медленно. С увеличением размеров кластера увеличивается и скорость присоединения или отрыва атомов железа; максимальная скорость обычно характерна для ядер, содержащих 2000-2500 атомов железа. При дальнейшем росте кристалла скорость обмена железом снижается. Такая закономерность связана с тем, что на самой поверхности ядра, достигшего необходимых размеров, образуются дополнительные центры окисления железа (32). Данный механизм также увеличивает способность ферритина экстренно поглощать или высвобождать железо.

Ферритин выполняет в организме двойственную функцию. Он запасает в клетках растворимое железо, которое при необходимости может быть легко задействовано для синтеза различных веществ. В то же время ферритин защищает организм от токсического действия ионов металлов. Помимо железа ферритин способен связывать и другие ионы, некоторые из которых токсичны (алюминий, бериллий).

Механизмы и кинетика обмена железа в организме изучаются очень интенсивно. Детально установить механизм процессов обмена железа in vivo очень сложно. Большинство исследований выполнено in vitro, и предложенные модели не могут быть полностью отождествлены с реальными процессами в организме.

Известно, что связывание железа трансферрином и ферритином требует предварительного изменения степени окисления металла от +2 до +3, а его высвобождение из этих молекул сопровождается обратным процессом восстановления. Важнейшую роль в этих процессах играют также низкомолекулярные хелатирующие соединения. Они являются необходимым промежуточным звеном в переносе железа от транспортных и депонирующих белков к местам утилизации железа.

In vitro железо может быть удалено и из ферритина, и из продукта его деградации гемосидерина (см. п. 4). Возможно высвобождение под действием небольших молекул-восстановителей, таких как 2,2-бипиридин, сульфонат батофенантролина, феррозин, дитионит и тиогликолят (33). Высвобождение железа стимулируют также многие физиологические восстановители: восстановленные флавины, супероксид, дигидролипоат и родственные сульфгидрилы, цитрат, аскорбат и АТФ.

Интенсивность обмена железа в ферритине может регулироваться за счет его структурных особенностей. В кристаллическом состоянии поры, ведущие в полость апоферритина, открыты всего лишь на несколько ангстрем, но динамические структурные флуктуации могут позволить некоторым низкомолекулярным восстановителям достаточно быстро проникнуть внутрь белковой глобулы, непосредственно провзаимодействовать с поверхностными атомами железосодержащего ядра, восстановить и удалить их. Хелатор Fe(II) (которым может быть и сам редуктант) помогает железу найти путь из глобулы. Низкомолекулярные хелаторы трехвалентного железа, которые мобилизуют Fe(III) из ферритина в течение часов и дней (гидроксипиридиноны), также могут входить в молекулу и покидать ее, неся железо в виде Fe(III)-хелатных комплексов. Такая модель подтверждается исследованиями Takagi e. a. (34), показавшими, что локальная перестройка в сайтах кооперативных взаимодействий субъединиц (области тройничной складчатости) может увеличивать скорость выхода железа из ферритина. При замещении консервативного лейцина в позиции 134 пролином белок формировался, окислял Fe(II) и минерализовал Fe(III), а время полного растворения минерала (480 атомов железа) in vitro снижалось до 5 мин по сравнению со 159 мин для родительского белка.

Подтвержден также тот факт, что большие железосодержащие ядра ферритинов, подвергшихся деградации в лизосомах (см. п. 4.), не могут встраиваться в апоферритин в неизменном виде: белковые субъединицы не могут формировать оболочку вокруг минеральных ядер. Необходимо предварительное растворение ядра и синтез его в полости апоферритина de novo. Сходным образом происходит и обмен железа между двумя молекулами ферритина, например, между плазматическим ферритином, несущим железо от клеток ретикулоэндотелиальной системы, и ферритином печени.

4. Катаболизм ферритина

Как любому биологически активному веществу, участвующему в протекании окислительно-восстановительных процессов, ферритину для сохранения функциональной активности необходимо регулярное обновление белковой части. Ферритин из цитоплазмы поступает в лизосомы, где происходит протеолиз белковой оболочки и частичная деградация железосодержащего ядра. Образовавшиеся структуры носят название сидеросомального ферритина. Затем железо освобождается от связавших его хелаторов и постепенно заключается в новую, интактную молекулу апоферритина. Данное предположение подтверждается наличием в сидеросомах электрофоретически подвижных субъединиц, подвергшихся радикальному отщеплению N-концевых аминокислотных остатков и вследствие этого меньших по массе, являющихся аналогами цитоплазматических Н- и L-цепей (35).

В условиях избытка железа способность клеток синтезировать необходимое количество ферритина истощается. При этом частично железо так и остается в слабо структурированной форме хранения - сидеросомальном ферритине, а также подвергается дальнейшей деградации до нерастворимого гемосидерина. Название отражает источник содержащегося в нем железа - гемоглобин, но в гемосидерине железо находится не в форме гема. Гемосидерин представляет собой агрегат гидроокиси железа, соединенного с белками, гликозаминогликанами и липидами. При электронной микроскопии гемосидерин виден как нерегулярные массивные кластеры электронно-плотных частиц, большинство из которых окаймлены мембранами.

Гранулы гемосидерина распознаются антителами к ферритину, но их иммунореактивность значительно ниже, чем у цитозольного ферритина (36). Эти данные подтверждают гипотезу, что гемосидерин - продукт деградации ферритина.

5. Регуляция биосинтеза ферритина

Механизмы регуляции биосинтеза ферритина интенсивно исследуются. Главным фактором, влияющим на метаболизм ферритина, является количество железа в организме. У животных и человека основным является посттранскрипционный механизм контроля. Механизм контроля трансляции был предложен после наблюдения, что в ответ на присутствие железа происходит увеличение количества ассоциированной с полисомами мРНК, при этом суммарное количество мРНК не возрастало, а уменьшалась фракция неактивной мРНК (37).

Секвенирование мРНК Н- и L-цепей ферритина показало наличие необычно длинных 5'-нетранслируемых областей (UTRs), размером соответственно 210 и 168 нуклеотидов (38). С помощью компьютерного анализа было предсказано существование в пределах первых 75 нуклеотидов специфической стержне-петлевой структуры. Такая последовательность - железо-ответственный элемент (IRE, iron responsive element) - необходима для регуляции железом трансляции мРНК.

Первоначально предполагалось, что цитоплазматическая мРНК могла инактивироваться присоединением субъединицы ферритина, действующей как репрессор, а железо вызывало дерепрессию, инициируя сборку в 24-меры ферритина, способные затем инкорпорировать железо. Последующие работы подтвердили данное предположение, но репрессорным белком оказалась не субъединица ферритина, а цитозольный белок с молекулярной массой порядка 90 кДа, который специфически связывается с IRE с высокой аффинностью (Kd=10-10-10-11M). Этот белок известен как IRE-binding protein (IRE-BP), iron regulatory factor (IRF), ferritin repressor protein (FRP), P-90 или iron regulatory protein (IRP). Было установлено, что IRP является белком цикла Кребса - аконитазой (39). Аконитаза содержит железосерный кластер (4Fe-4S), связывание железа в котором обратимо. В несвязанной форме (3Fe-4S) один из атомов железа в кластере замещается шпилькой мРНК, при этом аконитаза действует как репрессор трансляции. При повышении уровня железа в цитоплазме железосерный кластер принимает форму (4Fe-4S), шпилька мРНК вытесняется из кластера, аконитаза диссоциирует от мессенджера и начинается синтез субъединиц ферритина.

Важным фактом является то, что шпильки мРНК (IRE) свойственны не только для мРНК ферритина (40). Аналогичные структуры, способные связываться с теми же IRP, обнаружены в 3'-нетранслируемой области мРНК клеточного рецептора трансферрина (TfR), 5'-UTR эритроид-специфической синтетазы дельта-аминолевулиновой кислоты (eALAS).

Железо регулирует экспрессию TfR в направлении, противоположном экспрессии ферритина: высокий уровень железа ведет к низкой экспрессии TfR, и наоборот. Связывание c IRP предохраняет мРНК TfR от деградации. Таким образом, когда существует необходимость в железе, синтезируется больше TfRs, что позволяет клеткам захватывать больше железа, и когда клетки насыщены железом, синтезируется больше ферритина для защиты от токсического действия.

Первые стадии биосинтеза гема, возможно, лимитирующие скорость процесса, катализирует eALAS. Как и для ферритина, связывание с IRP блокирует инициацию трансляции eALAS.

мРНК митохондриальной аконитазы также содержит один IRE в 5'-UTR, который связывает IRP, поэтому и синтез собственно аконитазы может регулироваться железом. Когда количество железа ограничено, аконитазная активность IRP и, возможно, митохондриальных ферментов увеличивается с последующим увеличением потребления цитрата. При избытке железа происходит обратное, с возможным увеличением аккумуляции клеточного цитрата. Очевидная прямая координация уровня цитрата и железа физиологически важна, так как цитрат - одна из главных клеточных железосвязывающих молекул, подобная буферной системе.

Помимо железа, синте