Фармакогностическое изучение рода хвощ

Обзор литературы

Глава I1.1 Ботаническая характеристика рода хвощ, его химический состав, перспективность создания лекарственных препаратов

1.1.1 Ботаническое описание

1.1.2 Анатомическое строение (микроскопия)

1.1.3 Географическое распространение

1.1.4 Химический состав растений рода хвощ

1.1.5 Применение рода хвощ в народной и официнальной медицине

1.2 Новые противогрибковые препараты

Заключение

Глава II Материалы, методы и аппаратура

Глава IIIПерспективность использования рода хвоща для создания лекарственных препаратов

3.1 Перспективность использования рода хвоща для создания лекарственных препаратов

3.2 Биологическая активность и перспективность некоторых таксонов для создания лекарственных препаратов

Глава IV Изучение химического состава рода хвощ

4.1 Качественный состав

4.2 Количественное определение

4.3 Товароведческие показатели

Глава V Разработка технологического процесса получения сухого экстракта

Выводы

Литературный обзор

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: Проблема создания новых лекарственных средств растительного происхождения - одна из актуальных в современной фармации . Эта задача может быть решена за счет повышения качества существующих и внедренных новых лекарственных средств.

Количество растений , используемых в качестве лекарственных очень велико. Но только незначительная часть из них , наиболее важных и чаще применяемых, признана официнальной и входит в современную фармакопею.

Дикорастущим лекарственным растениям большой интерес уделяется благодаря обширным зонам произрастания, и, следовательно, позволяющим обеспечить потребности здравоохранения в лекарственном сырье.

Для лечения дерматологических заболеваний наряду с гормонами, антибиотиками и синтетическими продуктами в настоящее время успехом пользуются препараты, получаемые из лекарственного растительного сырья, преимущество которых состоит в широте фармакологического действия, малой токсичности, возможности длительного применения без побочных эффектов.

Хвощ, пользуется повышенным вниманием исследователей и клиницистов благодаря наличию ценных целебных свойств, достаточных площадей произрастания, а значит сырьевой базы.

Наряду с этим отмечается неполное изучение фармакологического действия хвоща , его лекарственных форм и методов оценки, что обусловило предпосылки для более углубленного изучения хвоща как лекарственного средства.

Обширный ареал произрастания позволяет использовать хвощ в качестве сырья для промышленного производства препаратов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Фармакогностическое изучение , разработка технологии экстракта хвоща сухого.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ:

1. Определить перспективный вид рода хвоща.

2. Изучить антигрибковую активность рода хвощ.

3. Изучить химический состав рода хвоща.

4. Разработка технологического процесса сухого экстракта хвоща.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые проведен фитохимический анализ некоторых видов рода хвощ, разработана технология получения экстракта, определена противогрибковая активность.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Разработана схема технологического процесса получения сухого экстракта хвоща полевого.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I.

1.1 Ботаническая характеристика некоторых видов рода хвощ, его химический состав, перспективность создания лекарственных препаратов.

1.1.1Ботаническое описание .

Хвощ полевой(Eqisetum arvenseL), семейство хвощевые (Eqisetaceae)- это многолетнее травянистое споровое растение с ползучим, глубоко погруженным, буровато-черным корневищем, нередко несущим шаровидные клубни. Стебли двоякого рода: спороносные, появляющиеся весной, и летние - бесплодные, остающиеся до осени.

Спороносные побеги не ветвистые, сочные, высотой 7-25 см, светло бурые с гладкими ребрами и колокольчатыми бурыми влагалищами, заканчиваются спороносным колоском. Колоски овально-цилиндрические, споры шаровидные зеленоватые. После осыпания спор спороносные стебли быстро отмирают, и из этого же корневища отрастают летние вегетативные побеги. Летние побеги прямостоячие, бороздчатые, высотой до 50-60 см, без колосков, зеленые, тонкие, членистые, жесткие с многочисленными ветвями, внутри полые. Ветви безлистные, в мутовках по 6-8, косо вверх направленные, простые, четырех-, пятигранные. Влагалища стеблей, представляющие собой редуцированные листья, цилиндрические, 4-8мм длины, с треугольно-ланцетными, черно-бурыми, белоокаймленными зубцами, обычно сросшиеся между собой по 2-3, влагалища веточек зеленые с 4-5 буроватыми, длиннооттянутыми зубчиками ( ) .

Сложный внешний вид имеют и другие виды хвощей, что существенно затрудняет установление подлинности.

Хвощ луговой (Eqisetum pratense L). Многолетнее , споровое, травянистое растение с нетолстым, ползучим черным корневищем без клубеньков. Спороносные стебли 10-20 см высотой, бледно-зеленые, простые, гладкие, по созреванию спор развивают зеленые ветви и становятся сходными с вегетативными побегами. Влагалища на них не более 1,5 см длиной, узкоколокольчатые. Колос 0,8-1,5см длиной, цилиндрический.

Хвощ лесной (Eqisetum sylvaticum L). Многолетнее, споровое, травянистое растение с тонким, ползучим, черно-бурым, ветвистым корневищем. Спороносные стебли 20-40 см высотой, до 0,5см в диаметре, рыжеватые или красноватые, простые с гладкими ребрами. Влагалища на них очень крупные, 1.5-3см длиной, 1см шириной, в нижней части зеленые, в верхней бурые, перепончатые, в числе 6-10. Колоски 2-4см длиной, цилиндрические. После созревания спор генеративные побеги зеленеют и развивают мутовки многократно ветвистых ветвей. Бесплодные стебли с10-14 ребрами. Влагалища 6-12см длиной, колокольчатые, бледно-зеленые, с ржаво-коричневыми лопастями. Ветви многочисленные, 3-5-гранные, тонкие, появляются из 4-5 узла.( ).

Хвощ болотный(Eqisetum palustre L). Болотное, гидрофильное растение. Корневище матово-черное, разветвленное, с клубеньками. Стебли 15-40 см высотой, 1.5-3 мм диаметром, зеленые, обычно ветвистые или простые, с тонко поперечно-морщинистыми крылатыми ребрами. Влагалища 5-12мм длиной, узкоколокольчатые, зеленые или темные, зубцы в числе 5-8, короче влагалищ, черно-коричневые, c широкой белой каймой. Ветви вверх направленные, колос 1-3см длиной, цилиндрический, тупой, на короткой ножке.( ).

Хвощ зимующий (Eqisetum hiemale L). Корневище почти черное, вертикально разветвленное. Стебли 50-80 см высотой, 3-5мм диаметром, цилиндрические, крепкие, жесткие, с широкой внутренней полостью. Ребра многочисленные, тонкие. Влагалища 5-10мм длиной, бледно зеленые, на верхушке и при основании черные, c 10-30 шиловидными зубцами, которые рано обламываются. Колос 1-3 см длиной, овальный, вверху заостренный.( ).

1.1.2 Анатомическое строение (микроскопия)

Поперечные срезы междоузлий стебля разных видов хвоща округлы и, соответственно с более или менее выступающими ребрами и вдавленными бороздками стебля. Центр стебля обычно полый и сердцевина отсутствует; находящийся вокруг центральной полости однорядный пояс проводящих пучков отграничен эндодермой от корковой части. В корковой части стебля под эпидермисом располагается колленхима сплошным или прерванным кольцом; больше всего она развита в выступах. За колленхимой следует хлорофилоносная паренхима, которая больше всего развита под бороздками, несущими устьица. В таких паренхимных участках образуются, путем расхождения клеток или разрыва, крупные воздухоносные полости. Против выступов ребер располагаются проводящие пучки. К периферии от пучковой полости расположена флоэма. Центр стебля занят крупной воздухоносной полостью.

Устьица имеют чрезвычайно своеобразное строение, характерное для всех видов хвоща. Сопровождающие клетки их снабжены на внутренней своей поверхности ребрами, выступающими в полость клетки. На поверхностных препаратах видны эти ребра, лучисто расходящиеся вокруг устьичной щели. По расположению устьиц различают два типа: у одних видов сопровождающие клетки расположены на уровне и в плоскости клеток эпидермиса, у других - они погруженные. При погруженных устьицах большое углубление над сопровождающими клетками частично перекрыто выступающим окременевшем краем наружных стенок соседних эпидермальных клеток, оставляющих только посредине неправильное отверстие. Так образуется большая воздухоносная полость над устьицем, отверстие которой и видно в первую очередь на поверхностных препаратах.

Виды хвоща хорошо отличимы между собой по контуру стебля, строению паренхимы, эндодерме и типу устьиц.

1.1.3 Географическое распространение

Хвощ полевой имеет космополитический тип ареала. Это самый распространенный вид хвоща, произрастающий почти по всюду, кроме пустынь, полупустынь, а также Крайнего Севера. Южная граница хвоща идет от Каспийского моря до Азовского, откуда поворачивает на восток, пересекает Волгу у Волгограда и реку Урал и уходит за пределы страны ( ).

Хвощ полевой растет на лугах, в еловых, светлохвойных, липовых, сосновых, сосново-березовых, березовых и смешанных лесах. Предпочитает пойменные места, берега рек, кустарниковые заросли, обочины дорог, откосы железнодорожных насыпей, песчаные и глинистые карьеры. Нередко образует на приречных илистых песках почти чистые заросли. Часто встречается в озимых и яровых посевах и является трудноискоренимым корневищным сорняком, считается индикатором кислых почв ( ).

Хвощ болотный наиболее распространен на травянистых и моховых болотах, лугах, зарослях прибрежных кустарников, по задерненным каменным россыпям и залежам, лесной полосе, в Европейской части заходит и в а Арктику, где найден по северному побережью Кольского полуострова, на Канине и на Колгуеве, через Большеземельную тундру доходит до Полярного Урала. В арктической Сибири отсутствует, и лишь на крайнем востоке найден в Анадыре. На юг вид распространен до Черного моря; распространен по всему Кавказу. Отсутствует в нижнем Поволжье и в Крыму; занимает всю Сибирь и весь Дальний Восток ( ).

Хвощ лесной распространен в лесах, зарослях кустарников, на лесных и субальпийских лугах, кочкарных болотах.

Хвощ луговой встречается в Западной Сибири, Тюменской области, в Хакасской автономной области, Курганской области, Омской, Новосибирской, Кемеровской областях. Чаще встречается в лесах, среди кустарниковых зарослей, на каменистых россыпях.

Хвощ зимующий произрастает в лесах, среди пойменных кустарников, на лесных лугах, обрывистых берегах рек, ручьев.

Хвощи можно встретить в разных растительных зонах и сообществах, но в любом случае близ воды или в местах с достаточным содержанием влаги в почве или с относительно не глубоким залеганием грунтовых вод.

Входя в состав пионерных растительных группировок и захватывая территории с нарушенным естественным растительным покровом, хвощи нередко образуют чистые или почти чистые заросли в тех местах, где другие растения не могут жить, например, из-за обилия воды или, напротив из-за ее недостатка в тех слоях почвы, где расположена корневая система этих растений. Раз поселившись на какой-нибудь территории, хвощи благодаря наличию глубоко залегающих корневищ, успешно противостоят таким неблагоприятным воздействиям внешней среды, как засухи, лесные пожары и т.п. и успешно конкурируют с другими растениями, долго удерживая захваченную территорию. Поселяясь на местах с нарушенным растительным покровом.

1.1.4 Химический состав растений рода хвощ

Первые работы по исследованию химического состава растений семейства хвощевых появилось в 40-х годах XX века. Ранние работы носили разрозненный характер и касались выделения и изучения лишь отдельных соединений (сапонинов, алкалоидов, флавоноидов) ( ).

Нахамура и Хукути (1940) выделили из хвоща полевого флавоноиды эквизетрин, изокверцетин и 5-гликозид лютеонина ( ). Позднее Харборн (1967) и Салех (1972) получил из сырья хвоща полевого флавоноидные соединения, производные кемпферола и кверцетина ( ).

Эти же соединения были идентифицированы чешскими учеными (1980) методом тонкослойной хроматографии и определено их количественное содержание. Сравнительное исследование химического состава польских видов хвоща также показало присутствие флавоноидов и фенолкарбоновых кислот во всех видах.

В нашей стране, в результате химического исследования свежей травы хвоща полевого и его спороносных стеблей, Сырчиной А.И. установлено наличие 26 фенольных соединений, в состав которых входят флавоноиды, фенолокислоты, и производные 1-инданона. Флавоноидные соединения хвоща полевого представлены: флавононами (нарингенин), флавонолами (аромодендрин, таксифолин, кемпферол, кверцетин), флавонами (генхванин, лютеолин, апигенин, 6-хлорапигенин)( ).

Этим же автором методом газожидкостной хроматографии в хвоще полевом идентифицированны оксибензойные и оксикоричные кислоты: п-оксибензойная, протокатеховая, ванилиновая, галловая, п-кумаровая, феруловая, кофейная( ).

Изучая растения рода Eqisetum, из хвоща полевого выделили сапонин - эквизетонин (до 5%), расщепляющийся при гидролизе на агликон - эквизетогенин и фруктозу ( ).

Обнаружены водорастворимые кислоты: аконитовая, арабиноновая, лимонная, фумаровая, глюконовая, малоновая, фосфорная, хинная, треоновая.

Хвощ полевой является рекордсменом среди растений по содержанию кремния. Так, в сухом веществе хвоща полевого содержится 9% кремнезема, а в золе до 96%. В соке хвоща полевого кремний обнаружен в растворимой форме кремниевой кислоты, связанной с органическими соединениями. С ростом растения содержание кремния возрастает, достигая максимума в конце вегетации. Также в хвоще найдены особые ферменты - силиказы, способствующие превращению неорганических соединений кремния в органические ( ).

Химический состав алкалоидов растений семейства хвощевых представлен в работах К. Эугстера, Губанова И.А., Баньковского А.И. и др. Хвощ полевой содержит в вегетативных органах небольшое количество (до 0,26%) алкалоидов (никотин, 3-метоксипиридин и палюстрин), являющийся общим для всех видов хвощей ( ).

Также в траве хвоща полевого обнаружены горечи, дубильные вещества, смолы, 30-190мг% аскорбиновой кислоты, 4.7мг% каротина, витамины группы В ( ).

1.1.5 Применение рода хвоща в народной и официнальной медицине

Препараты хвоща полевого (настои и отвары) назначают в качестве мочегонного средства при застойных явлениях сердечного происхождения (пороки сердца, сердечная недостаточность), а также при отеках , связанных с легочной недостаточностью, при плевритах, с большим количеством эксудата ( ).

При заболеваниях мочевыводящих путей и мочевого пузыря (пиелиты, циститы, уретриты), хвощ полевой используется одновременно с толокнянкой или другими растениями, обладающими мочегонными и противовоспалительными свойствами ( ). При нефрите и пиелонефрите применение препарата противопоказано, так как они могут вызывать раздражение почек ( ).

Широко используют траву хвоща полевого при геморроидальных, маточных, желудочных и других кровотечениях ( ).

Настой травы хвоща полевого применяется при водянке, туберкулезе легких, кишечных инфекциях, кровавом поносе, для удаления камней из почек, при головных болях, аддисоновой болезни, воспаления седалищного нерва, при ревматизме и подагре.

Учитывая способность хвоща ускорять выведение свинца из организма, его рекомендуют при остром и хроническом отравлении свинцом.

Трава хвоща полевого входит в состав противоастматической микстуры по прописи Тарсакова, пасты ‘’Фитолизин’’, противодиабетического сбора ‘’Арфазетин’’( ).

Применяют хвощ и для ухода за кожей лица. При жирной и пористой коже салфетки, смоченные настоем, накладывают на лицо. Настой травы хвоща полевого входит в состав косметических кремов ‘’ВТО’’ и ‘’Аленушка’’.

Также хвощ применяется как противозудное для лечения аллергических дерматитов ( ).

В народной медицине применяется не только хвощ полевой, но и другие виды хвоща.

Хвощ зимующий используется как мочегонное, вяжущее, кровоостанавливающее, болеутоляющее, седативное, потогонное средство; применяется при туберкулезе легких, при ревматизме, головных болях, при желтухе, грыже, для лечения язв, опухолей, воспалений.

Хвощ лесной тоже используется как вяжущее и мочегонное средство.

1.2 Новые противогрибковые препараты.

Инфекционные заболевания человека, вызываемые грибами, носят общее название микозы. Этиология, патогенез и клиническая картина микозов чрезвычайно разнообразны, однако практически во всех случаях этих заболеваний в патологический круг вовлекается кожа.

Подавляющее большинство патогенных и условно-патогенных грибов вызывают заболевание только при наличии факторов, снижающих нормальную физиологическую защитную функцию кожи и нарушающих резистентность организма против инфекции (особенно при иммунодефицитных состояниях). Количество этих причин в последнее время резко возросло (неблагоприятные экологические факторы, увеличение количества больных со злокачественными болезнями, особенно иммунной системы, широкое использование медицинских препаратов обладающих иммуносупрессивными свойствами: цитостатиков, гормонов, антибиотиков и т.д.)

Амиказол (Amycozolum)- 5% мазь и 2-5% пудра. Активен в отнашении дерматофитов и дрожеподобных грибов рода Candida.

Амфоглюкамин (Amphoglucaminum)- применяется при локализованных и глубоких микозах.

Анкотил (Ancotil)- выпускается в виде таблеток (0,5) и раствора для инфузий. Показания: системный кандидоз, криптококкоз и хромобластомикоз; аспергиллез.

Антифунгол (Antifungol)- активное вещество клотримазол. Выпускается в форме мази, вагинального крема и вагинальных таблеток.

Батрафен (Batrafen)- выпускается в форме крема, раствора и пудры для наружного применения, лака для ногтей и вагинального крема.

Гино-дактарин (Gino-dactarin)- вагинальные свечи по 0,1 г. Применение: местное лечение вагинальных кандидозов и суперинфекции, вызванных грамположительными микроорганизмами.

Гино- травоген (Gino-travogen)- шарики вагинальные по 0,6 г. Показания: грибковые инфекции влагалища.

Дактозин (Daktozin)- комбинированный препарат, выпускается в форме мази. Оснавное показание- лечение «пеленочного» кандидоза у детей.

Дифлюкан (Diflucan)- желатиновые капсулы по 0.05; 0.1; 0.15; 0.2; и раствор для инфузий. Применяется при лечении различных кандидозов и при профилактике грибковых инфекций у больных со злокачественными заболеваниями, которые предрасположены к таким инфекциям в результате химиотерапии цитостатиками.

Ламизил (Lamisil)- противогрибковый препарат для перорального и местного применения. Препарат обладает широким спектром противогрибкового действия.

Лоцерил (Loceril)- лак для ногтей- 5% по 5 мл, упаковка содержит также 60 тампонов, смоченных 70% изопропиловым спиртом в пакетиках из фольги, 10 лопаточек, 30 пилок для ногтей. Крем 0,25% по 20 г в тубах. Применение: микозы ногтей, стоп, гладкой кожи.

Низорал (Nizoral)- таблетки, крем, шампунь. Показания: грибковые инфекции кожи, волос, ногтей, половых органов.

Орунгал (Orungal)- капсулы по 0,1 г. Показания: заболевания кожи и слизистых оболочек, вызванные чувствительными к препарату грибами: кандидозный вульвовагинит, отрубевидный лишай, микозы, вызванные дерматофитами .

Толмицен (Tolmicen)- 1% паста,1% лосьон, 0,5% порошок. Показания: микозы гладкой кожи, складок, стоп, отрубевидный лишай.

Эконазол (Econasol)- крем 1%, лосьон 1% для наружного применения, аэрозоль 1% для местного применения. Обладает широким спектром действия.

Заключение

Растения рода хвощ - широко распространенное многолетнее дикорастущее травянистое растение, издавна использующиеся как в народной так и в официнальной медицине.

Выделены и изучены основные биологически активные вещества травы хвоща полевого: фенольные соединения, органические соединения кремния и сапонины.

Широкое использование средств на основе биологически-активных веществ хвоща в народной медицине побудило нас изучить его другие виды активности, чему посвящена экспериментальная часть работы.

Глава II. Материалы, методы и аппаратура

1. Объектом изучения служила надземная часть (трава) хвоща, собранная в середине лета в 1996-1998 г. на территории Томской области, сушка сырья воздушно-теневая.

2. В качестве извлекателей при получении экстрактов использовались: вода очищенная, этанол 70%,40%, 20%, хлороформ, ацетон.

3. Для хроматографии применяли бумагу хроматографическую Ленинградскую марки «М» в системе ацетон:бутанол:вода (7:2:1).

4. Аппаратура:

4.1 Спектрофотометр «Спектроскан»;

4.2 Сушильный шкаф;

4.3 Термостат ТС-80 МУ42;

4.4 Перколяторы лабораторные.

5.Качественный анализ содержания различных групп природных соединений.

5.1 Обнаружение алкалоидов.

Для обнаружения алкалоидов в исследуемом растительном сырье, готовили кислое извлечение: 5,0 г сырья заливали 50мл 1% раствором хлорноводородной кислоты и оставляли на ночь. Извлечение фильтровали и определяли в нем алкалоиды с помощью общеосадительных реактивов:

1.) реактив Драгендорфа;

2.) реактив Фреде;

3.) реактив Вагнера;

4.) 1% раствор пикриновой кислоты;

5.) 1% раствор кремниево-вольфрамовая кислота;

6.) 1% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты;

7.) 1% раствор фосфорно-молибденовой кислоты.

5.2 Обнаружение флавоноидов.

Для качественного обнаружения флавоноидов проводили цианидиновую пробу (проба Синода).

1,0 г сырья заливались 10 мл 96% этанола и нагревались на водяной бане до кипения. Колба встряхивалась несколько раз, закрывалась пробкой и оставлялась на 3-4 часа. Спиртовое извлечение сливали и концентрировали до 2-х мл, к нему добавляли 5-7 капель концентрированной хлорноводородной кислоты и 10 мг металлического цинка.

5.3 Обнаружение дубильных веществ

Приготовление извлечения: 1 г измельченного растительного сырья заливали 100 мл воды. Нагревали на водяной бане 20-30 мин, процеживали через вату и полученное извлечение использовали для проведения качественных реакций.

5.3.1 К 2-3 мл извлечения прибавляли несколько капель раствора железоаммониевых квасцов в случае гидролизуемых дубильных веществ появляется черно-синее окрашивание или осадок, а конденсированных- черно-зеленое окрашивание или осадок.

5.3.2 К 1 мл извлечения добавляли 2 мл раствора 10% уксусной кислоты и 1 мл раствора 10% средней соли ацетата свинца. При наличии конденсированных дубильных веществ фильтрат окрасится в черно-зеленый цвет от прибавления 5 капель 1%-ных железоаммониевых квасцов и 0,1 г ацетата свинца.

5.4 Обнаружение сапонинов.

Приготовление извлечения. Готовили водный настой 1:10, нагревая измельченное сырье на водяной бане в течение 10 мин. Настой после охлаждения фильтруют и проводят с ним реакции.

Реакция пенообразования. Берут две пробирки, в одну приливают 5 мл 0,1 моль/л хлорноводородной кислоты, а в другую- 5мл 0,1моль/л гидроксида натрия. Затем в обе пробирки добавляют по 2-3 капли извлечения или растворов сапонинов и сильно встряхивали. При наличии в сырье тритерпеновых сапонинов в обеих пробирках образуется устойчивая пена.

5.5 Обнаружение алифатических кислот.

5.5.1 Щавелевая кислота.

К 2 мл водного извлечения добавили 4 капли раствора кальция сульфата насыщенного, в результате должен образоваться осадок растворимый в соляной кислоте и не растворимый в уксусной кислоте.

5.5.2 Янтарная кислота.

К 1 мл извлечения добавить несколько кристалликов резорцина, затем по стенке пробирки добавить 0,5 мл концентрированной серной кислоты, охладить и добавить 0,5 мл 10% раствора гидроксида аммония, должна появиться зеленая флуоресценция.

5.5.3 Лимонная кислота.

1 мл извлечения поместить в выпарительную чашку, добавить несколько кристалликов ванилина и выпарить досуха. К остатку добавить 2-3 капли конц. серной кислоты, нагреть на водяной бане до появления фиолетового окрашивания.

5.5.4 Яблочная кислота.

К 2 мл экстракта добавить 0,1 b-нафтола и 1каплю конц. серной кислоты. Опустить пробирку на 1/2 мин в кипящую водяную баню должна появиться ярко-желтая с зеленым флуоресценция.

5.5.5 Винная кислота.

4 капли водного экстракта выпарить досуха в фарфоровой чашке, добавить 1 мл конц. серной кислоты и несколькими кристалликами резорцина, нагреть на водяной бане до появления вишнево-красного окрашивания.

5.6 Обнаружение полисахаридов.

К 8,0 сырья добавили 260 мл воды, затем взбалтывать в течении 1 часа, оставили на одни сутки на холоду, слили с сырья извлечение и профильтровали его. В фильтрате осаждали водорастворимые полисахариды ( предварительно упарив фильтрат до1/3) 2-х кратным объемом 96% этанола (фр.А).

Оставшееся сырье обработали 100 мл кипящей водой очищенной с 0,4 мл конц. хлорноводородной кислотой и 30 мин выдержали на кипящей водяной бане. Затем в фильтрате осаждали пектиновые вещества 2-х кратным объемом 96% этанола (фр. Б).

Сырье обрабатывали 10% раствором гидроксида натрия, оставляли на сутки, затем фильтровали и в фильтрате осаждали полисахариды 50% уксусной кислотой (фр. В).

Каждую фракцию в отдельности отфильтровывали на воронке Бюхнера. Осадки сушили при температуре +90 °С до постоянной массы.

Далее проводили кислотный гидролиз. Точную навеску (0,1) каждой фракции помещали в ампулы, добавляли в каждую по 5 мл 10% раствора серной кислоты. Ампулы запаивали и нагревали при температуре +105°С в течении 3-х часов. Ампулы охлаждали и содержимое количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, объем доводилим до метки водой (раствор А).

10 мл гидролизата (раствора А) разбавить 5 мл воды и нейтрализовали порошком карбоната бария по универсальной индикаторной бумаге. Раствор фильтровали через бумажный фильтр, промыв водой. Полученный фильтрат упаривали до объема 0,5 мл (раствор Б).

На хроматографическую бумагу Ленинградской фабрики марки «М» наносим 0,02мл упаренного фильтрата и стандартные образцы сахаров, хроматографировали восходящим методом в системе ацетон:бутанол:вода (7:2:1).

Высушенную хроматограмму обрабатывали анилинфитолатом и сушили в сушильном шкафу при температуре +105°С до появления пятен.

Нейтральные сахара:

- глюкоза Rf-0.15;

- галактоза Rf-0.12;

- арабиноза Rf-0.24;

- ксилоза Rf-0.27;

- рамноза Rf-0.4.

Приготовление анилинфитолата:

0,93 сернокислого анилина

1,66 фталевой кислоты

100 мл водонасыщенного бутанола.

5.7 Обнаружение кремния

Для идентификации соединений кремния проводили качественую реакцию образования желтого и синего кремнемолибденового комплекса с молибдатом аммония в кислой среде. В качестве восстановителя использовали аскорбиновую кислоту.

Для этого 1,0 г измельченного сырья сжигали в фарфоровом тигле на электрической плитке и прокаливали в муфельной печи. Затем золу обрабатывали 1% раствором хлороводородной кислоты, фильтровали, осадок на фильтре промывали 1% раствором хлороводородной кислоты и растворяли в 5% растворе гидроксида калия. С раствором силиката калия проводили реакцию с 10% подкисленным раствором молибдата аммония, приготовленного следующим образом: к 90 мл 11% раствора молибдата аммония прибавляли 10 мл 50 % раствора серной кислоты.

К 1 мл полученного раствора силиката калия прибавляли 2 мл 10% подкисленного раствора молибдата аммония, должно образоваться желтое окрашивание, при добавлении нескольких кристалликов аскорбиновой кислоты желтая окраска должна переходить в интенсивно синий цвет.

5.8 Обнаружение эфирных масел.

Использовался метод перегонки водяным паром. Навеску измельченного сырья помещают в широкогорлую круглодонную колбу вместимостью 700-800 мл, приливают 300 мл воды и закрывают резиновой пробкой с обратным холодильником. В пробке снизу укрепляются металлические крючки, на которые при помощи тонкой проволоки подвешивают градуированный приемник так , чтобы конец холодильника находился точно над воронкообразным расширением приемника, не касаясь его. Колбу с содержимым нагревают до кипения и слабо кипятят.

Пары воды и эфирного масла конденсируются в холодильнике и жидкость стекает в приемник. Масло отстаивают в градуированном колене приемника, а вода через меньшее колено приемника вытекает обратно в колбу.

5.9 Обнаружение сесквитерпеновых лактонов.

50 мл водного извлечения (1:10) помещали в делительную воронку, добавляли 10 мл хлороформа и осторожно взбалтывали, затем хлороформное извлечение сливали в колбу. К этому же водному извлечению добавляли свежую порцию хлороформа, второе извлечение объединяли с первым. Затем хлороформ отгоняли под тягой до получения «смолки».

ИК-спектр снимали на спектрофотометре «Specord UR» с призмами Li F и NaCl в таблетках KBr высотой 1 мм при соотношении веществ, наполнителя 1:400 и в пленке.

6. Количественное определение флавоноидов

Около 1,0 г сырья помещали в колбу с притертой пробкой на 50 мл, заливали 20 мл 90% этанола с содержанием 2%-тов концентрированной хлороводородной кислоты, экстрагировали с обратным холодильником на кипящей водяной бане и декантировали в мерную колбу на 50 мл. Извлечение повторяли еще дважды, заливая по 10 мл 90% подкисленного этанола. Объединенное извлечение доводят до метки 90% этанолом.

0,2 мл экстракта наносили на полоску хроматографической бумаги размером 45´15 см и хроматографировали в системе 0,1 М хлороводородной кислоты. Хроматограмму высушивали, в УФ-свете отмечали пятна флавоноидов, вырезали и элюировали 96% этанолом три раза по 10, 5 и 5 мл в колбе спритертой пробкой с обратным холодильником на водяной бане. Полученное извлечение флавоноидов сливали в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки 96% этанолом и снимали оптическую плотность элюятов с помощью спектрофотометра с толщиной слоя 1 см при длине волны 353нм.

Сумму флавоноидов пересчитывали на кверцетин (Е =387,5) поформуле:

C= Д*У1*К*У2*100/(Е *I*М*(100-В)*У3,где

Д- оптическая плотность

У1- объем первого извлечения, мл (50 мл)

У2- объем второго извлечения, мл (25мл)

У3- объем, пошедший на хроматографирование, мл (0,2 мл)

Е -удельный показатель поглощения

М- масса навески, г

В- влажность сырья, %

I- толщина слоя, см

К-поправочный коэффициент на неполное элюирование с бумаги (1,15)

7. Количественное определение соединений кремния

В предварительно прокаленный фарфоровый тигльпомещали около 1,0 г сырья, сжигали и прокаливали в муфельной печи при температуре не выше 560-650 °С до постоянной массы (3-5 часов).

После охлаждения золу количественно переносили в стакан емкостью 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора хлороводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Полученный раствор отфильтровывали через рыхлый беззольный фильтр, осадок промывали 1% раствором хлороводородной кислоты.

Фильтр с осадком переносили в коническую колбу на 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора гидроксида калия, затем прикрыв часовым стеклом, нагревали до кипения и кмпятили в течение 20 мин (колбу перед нагреванием взвесили). После охлаждения содержимое колбы доводили до первоначальной массы 5% раствором гидроксида калия.

1 мл полученного фильтрата помещали в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл 5% раствора серной кислоты, доводили водой до метки. Через 15 мин определяли оптическую плотность с помощью фотоэлектроколориметра в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 400 нм, используя в качестве раствора сравнеия фильтрат без добавления реактивов.

8. Методика определения экстрактивных веществ.

20 г сырья измельчали и просеивали сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм, помещали в коническую колбу прилив растворителя до «зеркала». Колбу закрывали пробкой, взвешивали и оставляли на 16 часов. Затем содержимое тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой фильтр в сухую колбу. Фильтрат переносили в фарфоровую чашку диаметром 7-9 см, предварительно высушенную при t° +100°C до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха, и сушат при t° 100-105°С в течении 3 часов, охлаждали в эксикаторе и взвешивали.

9. Определение микроэлементного состава.

Для определения минерального состава травы хвоща использовался рентгено-флуоресцентный метод.

В чашку (тигль) берут навеску измельченного продукта (пробы взвешивают с погрешностью не более + 0,01 г), помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре около +105°С.

Содержимое чаши смачивают 2-3 мл 32% раствором азотной кислоты и нагревают на водяной бане до прекращения выделения паров. Обработку азотной кислотой повторяют еще дважды. Затем чашу помещают на электроплитку и проводят обугливание до прекращения выделения дыма, потом чашу переносят в электропечь при температуре около +250°С. Минерализацию проводят, постепенно повышая температуру электропечи на +50°С через каждые 30 мин и, доведя ее до температуры +450°С, продолжают минерализацию при этих условиях до получения золы. Чашу с золой извлекают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и смачивают золу 0,5-1,0 мл 32% раствором азотной кислоты. Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь при температуре, постепенно доводя температуру до 450°С и выдерживают 1 час. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой.

В чашу с золой добавляют 10 мл 32% раствора азотной кислоты, нагревают на электроплитке со слабым нагревом до появления запахов азота. Содержимое чаши фильтруют в стакан через фильтр «белая лента». Тщательно ополаскивают чашу водой очищенной, фильтруя смыв чаши в тот же стакан. В фильтрат, содержащий тяжелые металлы добавляют азотнокислый цирконил, нагревают, фильтруют. Полученный осадок анализируют на приборе спектрометре «Спектроскан».

10. Исследование антигрибковой активности

С целью изучения антигрибковых свойств БАВ хвоща полевого воздушно-сухое сырье измельчали до размера частиц 2-5 мм, заливали до «зеркала» экстрагентом (вода очищенная, этиловый спирт 70%, бутанол, хлороформ, эфир) настаивали в течении 16 часов, фильтровали и полученные экстракты высушивали в струе воздуха, нагретого до +30°С.

Антигрибковые свойства полученных экстрактов исследовали методом двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро по методике Вичкановой С.А.. Состав среды Сабуро:

- 10,0 пептона,

- 40,0 мальтозы,

- воды очищенной до 1 л.

В качестве тест-культуры использовали штаммы Aspergillus niger 163/3685, Candida albicans 4337, Trichophiton rubrum ВКПГ248/700, T. Mentagrophytes var. Interdigitale ВКПГ 268, Microsporum canis ВКПГ 326/316, которые были получены в отделе микологии центрального кожно-венерологического института Министерства здравоохранения России г. Москва.

Подготовка грибов-дерматофитов к опыту, посев и их учет проводили по методу Г.Н. Першина. Для посева использовали суспензии как правило, суточной агаровой культуры дрожжей, культуры плесневого гриба 4-5 суточные, остальных дерматофитов 7-10 суточные. Взвеси грибов готовили в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности.

После дополнительных разведений стандартного раствора микробная нагрузка патогенных грибов составляла 1000 грибковых тел в 1 мл среды. Посевы инкубировали в термостате, дрожжи при 37°С, остальные при 33°С.

Учет культуры дрожжей проводили через 24 часа, другие культуры на 7-10 сутки. Предельная доза препарата испытанная нами, соответствовала 1000 мкг/мл. Повторность каждого опыта 4-6 кратная. Контролем служили пробирки с питательной средой, засеянные аналогичным количество тест-культуры, а также пробирки со средой и препараты без культуры (для проверки мутности и осаждения препарата).

За критерий антигрибковой активности препарата принимали фу